今天分享一篇由苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的Jeffrey Bode教授于2019年发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，ChemicalSynthesis of Atomically Tailored SUMO E2 Conjugating Enzymes for the Formationof Covalently Linked SUMO–E2–E3 Ligase Ternary Complexes.Jeffrey Bode教授研究领域主要包括多肽和蛋白质的合成，饱和氮杂环的制备以及通过“合成发酵”法制备有机分子。
泛素化（Ub）、SUMO化和其他的ubiquitin-like（Ubl）修饰过程涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应，它们与底物蛋白之间的特异性相互作用是由蛋白-蛋白相互作用介导并受多种因素调节。Krist和Statsyuk通过对E2表面暴露的Cys残基进行位点特异性修饰引入二嗪使E2 UbcH7与泛素连接酶E3 E6AP进行光交联。但是这种方法仅用于捕获HECT型连接酶，不适用于其他类别的E3。作者考虑到在大多数情况下泛素结合酶E2的大小适中（150-180个残基），可以通过化学合成带有任何所需修饰的基于E2的探针。
在本文中，作者组合使用了三种化学连接方法，，包括天然化学连接（NCL）、α-酮酸-羟胺（α-ketoacid-hydroxylamine: KAHA）连接和丝氨酸/苏氨酸连接（serine/threonine ligation: STL），化学合成了带有特定非天然氨基酸修饰的SUMO缀合酶Ubc9变体。这种方法可以在短时间内制备许多在不同位点带有多个修饰的Ubc9变体。这些突变体可用于（1）将Cys93替换为2,3-二氨基丙酸（2,3-diaminopropionic acid: Dap）以形成稳定的E2-SUMO复合物；（2）光反应性基团（双吖丙啶）在紫外线照射下捕获E3连接酶；（3）用于纯化和检测的N端生物素（Figure 1）。
本文中，作者选择了SUMO E2缀合酶Ubc9进行化学合成并引入光亲和标签，以构建基于E2连接酶的探针。Ubc9是一种具有158个氨基酸残基的结合酶，其特征在于激活酶E1将SUMO转移到Cys93上形成E2-SUMO复合物，尽管空载的E2通常对E1具有很高的亲和力，但E2-Ub/Ubl复合物的形成会引起构象变化导致对E3连接酶的亲和力更高，从而合成的E2可作为化学探针来鉴定E3连接酶。
作者选择Ubc9的Gly34–Thr35、Lys74–Cys75和Ile107–Thr108作为连接位点（Scheme 1）。首先通过Fmoc-SPPS在2-Cl三苯甲基树脂上制备用于STL连接的片段S1，在树脂裂解和整体脱保护后C末端被转化为水杨醛酯。S2是在负载有肼的2-Cl三苯甲基树脂上制备，接着用NaNO2氧化形成叠氮后与3-巯基丙酸反应形成末端硫酯。然后通过STL将片段S1和S2组装在一起（Scheme 1）。接下来，作者在Rink{attr}2124{/attr}树脂上使用被保护的异亮氨酸α-酮酸作为C-末端残基，裂解和整体脱保护后获得了含有C端α-酮酸片段S3。通过常用方法以Boc-(S)-5-oxaproline作为N-末端残基合成片段S4。然后通过KAHA将S3与S4连接，在碱性条件下进行O到N的酰基转移得到S6（Scheme 1）。S5和S6直接进行NCL反应生成全长Ubc9蛋白。
已有研究表明稳定的Ubc9–SUMO复合物会优先与E3连接酶相互作用，所以为了在Ubc9和SUMO之间形成稳定的酰胺键，作者将Ubc9的Cys93突变为Dap。此外作者还引入带有光交联侧链的非天然氨基酸用于蛋白质偶联。最后，为了促进亲和纯化和生化检测，作者在N端安装了生物素标签（Scheme 2）合成了一系列Ubc9变体。
接下来，作者使用RanGAP1作为底物，在ATP依赖的SUMOylation分析中评估了合成的Ubc9变体（图2a）。使用市售的重组Ubc9作为阳性对照，Ubc9（Thr108Hse）的活性与重组Ubc9并无区别，RanGAP1能够被SUMO的三种亚型（SUMO1，SUMO2和SUMO3）SUMO化（Figure 2b, lanes 3 and 2, 9 and 8, and 12 and 11）。为了评估携带Cys93Dap突变的Ubc9变体与SUMO形成复合物的能力，在激活酶E1和ATP的存在下将SUMO1与Ubc9进行体外偶联反应，对于Ubc9（Thr108Hse，N-biotin），观察到单一的SUMO化形式（Figure 2c, lanes 1 and 2），且SUMO1与Ubc9（Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）的结合（Figure 2c, lanes 3 and 4）取决于ATP和E1（Figure 2c, lanes 6 and 7）。
为了研究双吖丙啶是否可以选择性地与E3连接酶偶联，作者选择了可有效增强Sp100 SUMOylation的E3连接酶RanBP2。为了测试Ubc9变体中双吖丙啶的反应性，作者尝试使用Sp100作为底物蛋白捕获RanBP2，发现使用Cys93Dap变体Ubc9（F22F*, Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）时观察到形成了清晰的新的条带（Figure 3b, lane 6, red triangle; Figure 3c, entry 2 ）。接下来通过一系列对照试验（Figure 3）发现E3连接酶和底物蛋白的结合能够有效促进其与SUMO1–Ubc9共价复合物的结合。
最后，为了研究Ubc9（F22F*, Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）能否捕获细胞裂解物中的内源性RanBP2，作者构建了Ubc9–SUMO1探针，并在存在底物Sp100的情况下与HEK293T细胞裂解物一起孵育，富集和纯化后进行了蛋白质组学分析发现内源性RanBP2能够被Ubc9（F22F*, Cys93Dap, Thr108Hse, N-biotin）捕获，通过对照试验发现E3连接酶（RanBP2）的捕获取决于光交联基团和紫外线照射。
综上所述，作者提供的方法为构建各种Ubc9变体提供了一个平台，以研究它们与其他蛋白质的相互作用，为开发复杂的蛋白质探针提供了可能。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b06820
