今天给大家分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的研究，题为：Glycopeptide Self-Assembly Modulated by Glycan Stereochemistry through Glycan−Aromatic Interactions。文章的通讯作者是北京大学的董甦伟教授。
糖类物质在自组装糖肽（glycopeptides）中提供着亲水性和羟基氢键，在生物医学研究中应用广泛。糖基的大小的结构可以影响肽段的自组装能力，一种设想认为糖基在其中提供羟基氢键促使肽段间聚集，聚集造成的空间效应会协同其他疏水作用力，如π-π相互作用，从而形成自组装。然而这种理解缺乏结构基础的支持，也忽略了糖的立体构型，因此并不能完全解释糖基化相较于其他羟基结构而言（如磷酸化）对自组装产生的明显影响。在这里，作者研究了不同单糖修饰的糖肽序列的自组装行为和水凝胶形成能力，从而揭示了糖基直立碳氢键与芳香基团间的CH-π相互作用才是超分子自组装结构稳定形成的关键所在。
首先作者对序列和糖基化修饰位点进行了筛选，基于先前报道的通过二硫键连接的多肽二聚体[Tyr-Tyr-Cys-Tyr-Tyr]2可以实现二维自组装，通过在酪氨酸的酚羟基位点进行不同的糖基化修饰。如图1所示，其中一些多肽序列表现出凝胶性质，这为后续研究超分子自组装提供了额外的视角（如熔点），也为其作为生物材料提供了更多的应用，故选定糖肽4作为研究重心。
图1. 糖肽序列及糖基化位点筛选
随后作者以糖肽4为基础，制备了不同糖基不同糖型的二聚糖肽体系（图2），绝大多数都能形成白色水凝胶，当糖基含有一个直立键羟基时，立体化学性质会影响其自组装能力。紧接着作者使用透射电子显微镜（TEM）对水凝胶形态进行了观察，在水相中，糖肽聚集成纳米纤维，缠结成纳米束，将水分子困在3D网络中形成凝胶。
图2. 不同糖基修饰的糖肽
为了解释自组装过程的机制，作者对糖肽4进行了一系列测量获得其结构信息。ThT染色实验（图3a）表明随着样品浓度增加，荧光轻度增加，说明自组装中肽段呈β折叠结构；红外光谱中酰胺特征峰的位移也暗示着β折叠的形成（图3b）。随后作者得到了糖肽4的单晶，进一步揭示其构象：两个戊肽段呈反向平行构象组成基本单元，以左螺旋方向堆积，纳米尺度数据表明水凝胶中观察到的自组装机制与晶体中构象观察到的类似。进一步观察发现不仅仅是β折叠间的氢键在推动自组装（图3e），半乳糖单元与相邻二聚糖肽的芳香环距离很近（图3d），而芳香-芳香相互作用在体系中却没有观察到。基于上述观察，作者推测糖基C-H和芳香π键间存在相互作用并介导了水凝胶的形成。
图3. 糖肽4的自组装结构
CH-π键的形成与糖基的立体化学有关，涉及直立碳氢键的分布与糖苷键的取向，只有当碳氢键与芳环取向合适时才能产生明显的相互作用。为进一步验证这种作用力的主导作用，作者在相关的酪氨酸侧链上对酚羟基进行了不同的取代（H、F、CN、NO2）并对比其凝胶性质。流变学测试表明随着芳环富电性减弱，水凝胶的储能模量下降，因为其中CH-π相互作用因芳环更加缺电子而下降了，证实了CH-π相互作用在自组装中的重要作用。
多肽水凝胶应用前景很大，但问题在于天然氨基酸形成的肽段容易被酶降解，在生理条件下半衰期短，可使用非天然D构型的氨基酸来解决。但对于糖肽而言这一方法并不适用，因为常见糖基的对映异构体并不好获得，此外D型氨基酸与天然糖的结合是否能保持自组装性质也很难预测。在此作者为糖肽体系提供了一个解决方案（图4），因为成镜像的两个糖肽体系具有相同的结构参数，所以非天然的[yycy(β-D-Glc)y]2糖肽应该具有和天然的[YYCY(β-L-Glc)Y]2糖肽相似的CH-π相互作用，从而能由天然糖肽的水凝胶性质有效预测其镜像的D-糖肽的水凝胶性质。随后作者合成了[yycy(β-D-Glc)y]2从实验上验证了其形成水凝胶的能力，相较于基于天然糖肽[YYCY(β-L-Glc)Y]2在蛋白酶存在下2天后明显降解，镜像的非天然糖肽[yycy(β-D-Glc)y]2具有良好的对蛋白酶K抗性，5天后未见明显降解，同时在这类超分子体系中也可以用易得的糖基来代替难得到的糖基，只要保证满足CH-π键成键要求即可。
图4. 利用天然糖肽糖凝胶指导非天然酶抗水凝胶的开发
总的来说，本文报道了一种富含酪氨酸的二聚糖肽自组装结构，其中芳香基团与糖基有密切的相互作用，这与之前疏水端和亲水端尽可能远离的设想不同。糖基作为CH-π氢键的给体，相较于之前观察到的羟基氢键更加关键，改变糖基的立体化学性质可以调节CH-π键的强度从而改变自组装过程和纳米结构的性质，这种糖肽的自组装也能衍生到D型糖肽结构中得到酶抗水凝胶，对糖肽的设计和凝胶应用的开发有着指导作用。
作者：LXY 审校：WH
DOI: 10.1021/jacs.0c06360
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06360
