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Biomacromolecules | 简易合成具有优异抗菌活性的咪唑基嵌段共聚物

今天为大家分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的文章, Facile Synthesis of Imidazolium-Based Block Copolypeptides with Excellent Antimicrobial Activity。这篇文章的通讯作者是中国科学院长春应用化学研究所的张旭研究员,栾世方研究员和湘潭大学化学学院唐浩宇教授。

所有多细胞生物都能天然表达抗菌肽(AMPs),它们可以通过破坏膜结构等机制来抵抗细菌,但是AMPs对哺乳动物的细胞毒性高且生产成本高,这阻碍了它们的进一步发展。为了获得具有高效抗菌活性和优异生物相容性的材料,人们通过模拟AMP的两亲性和带正电荷结构,已经开发出可用于抗菌的阳离子聚合物。两亲性嵌段共聚肽能够通过刺穿破坏细菌的膜结构形成具有强活性的抗菌胶束,同时具有加长疏水侧链的离子多肽显示出稳定的二级结构,以抵抗pH、温度或盐引起的变性。此外,氨基引发的N-羧基环内酸酐(NCA)开环聚合为多肽提供了一种超高效的合成策略。

本文作者报道了一种具有α-螺旋构象的咪唑基嵌段共聚肽的简易合成方法。如图1所示,作者使用双(2-氨基丙基醚)聚丙二醇(PPG-BA)引发γ-4-3-氯丙氧羰基)苄基-L-谷氨酸基-N-羧酸酐(CPBLG-NCA)进行开环聚合,然后经亲核取代将侧链上的Cl原子替换为叠氮基,最后通过1,3-偶极环加成将带正电荷的咪唑鎓环有效修饰在多肽骨架上。

on style="font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-stretch: normal; line-height: normal; font-family: KaiTi; text-indent: 0em; white-space: normal; text-align: center;">1. 咪唑基嵌段共聚肽的合成路线

作者研究表明,含咪唑鎓环的同多肽(PlmX, X= I or BF4)能够在低浓度下抑制金黄色葡萄球菌的生长,另外具有正丁基端基和BF4-抗衡阴离子(即1-PlmBF4)的PlmX具有最高的抗菌活性而且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌显示出低的最小抑制浓度(MIC)。同时,1-PlmBF4还对哺乳动物细胞显示出低细胞毒性。为了得到同时具有优异抗菌活性和生物相容性的多肽,作者分别使用疏水性的PPG-BACPBLG-NCA作为大分子引发剂和单体,以及DCM作为低极性反应溶剂,以促进相邻α-螺旋的快速协同聚合。

如图2所示,FTIR光谱监测结果表明PPG-BA引发的CPBLG-NCA的聚合反应在500 s内完成,远快于1,6-己二胺在相似条件下的反应。作者推断PPG片段的卷曲构象有利于相邻α-螺旋传播链的接近,从而促进CPBLG-NCA的开环聚合中的协作作用,导致了超快的开环聚合过程。此外,如图3所示,通过改变单体和引发剂浓度比可以得到分散度小,分子量接近理论值的PPGn-PCPBLGm,说明聚合反应可控性好。

2. 不同[M]0(a)[M]0/[NH2]0(b)下的反应动力学表征

3. 不同[M]0/[NH2]0下的PPGn-PCPBLGm产品表征


近来,H2O/DCM(或TCM)二元溶剂体系中的协同开环聚合反应的最新发展未使用未纯化的NCA低成本生产多肽提供了新方法。遵循这一策略,作者尝试了在TCM/NaHCO3/H2O二元溶剂体系中使用PPG-BA引发未纯化的CPBLG-NCA进行聚合。如图4所示,低浓度NaHCO3浓度(50 mM)下,NCA只消耗不到10%。在高浓度NaHCO3浓度(500 mM)下,即使在[M]0/[NH2]0=90的浓度条件下,反应也能在17分钟左右完成,同时GPC结果反应具有良好可控性。

4. (a)不同NaHCO3浓度下的动力学表征 (b) NaHCO3浓度为500 nM时,不同[M]0/[NH2]0下产物的GPC曲线


作者得到PPGn-PCPBLGm三嵌段共聚物后,通过在DMFNaN3进行侧链改性引入叠氮基,然后通过“点击化学”反应成功将咪唑鎓环修饰到聚合物侧链上,即制得PPGn-PILm1H NMR结果表明,NaN3处理后发生了接近定量的取代反应,同时咪唑鎓悬垂物成功与嵌段共聚物缀合,密度达到99%以上。此外,FTIR酰胺Ⅰ(1653 cm-1)和酰胺Ⅱ(1547 cm-1)谱带表明得到的三嵌段共聚物在固态下具有α-螺旋构象。如图5所示,在溶液中,具有不同链长的PPGn-PILm显示出与对应同多肽相同的α-螺旋构象。

5. PBS溶液中PPGn -PILmCD光谱(20 ℃, 0.1 mgmL-1)

PPGn-PILm在水溶液中可以聚集形成自组装结构,直径为31.9-58.6 nm,如图6DLS结果所示。TEM结果(图6)表明,含咪唑鎓环的三嵌段共聚物形成球形胶束,直径约为44 nm,略小于DLS确定的直径,这可能是因为聚合物状态不同。该具有离子层的两亲性嵌段共聚物的球形胶束可以提高局部电荷密度,通过破坏细菌膜结构来增强抗菌活性。

6. PPGn-PILm在水溶液中的尺寸分布(插图:PPG34-PIL70TEM图像)


作者通过微量稀释法测试PPGn-PILm对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗微生物活性,如图7(a)所示。结果表明,PPGn-PILmMIC值在25-200 μgmL-1以内,表明具有良好的抗微生物活性。其中,具有中等肽链长度的PPG34-PIL70表现出最佳抗菌活性。虽然未能得出普遍的MW与抗菌活性之间的关系,我们可以假设低分子量聚合物具有小的聚集尺寸,能更有效地穿透大肠杆菌细胞壁并干扰细胞代谢,从而导致对大肠杆菌的MIC较低;相比之下,高分子量聚合物具有更多阳离子基团,进而提高了与阴离子细菌细胞壁的静电相互作用,对金黄色葡萄球菌表现出更强的杀菌效果。PPGn-PILmMIC(25 μgmL-1)可以低于CMC(28.8-31.6 μgmL-1),表明单个PPGn-PILm分子仍具有较高的抗菌活性。此外,如图7(b)所示,PPGn-PILm0.1 mgmL-1时的溶血率低于5%,表明具有良好的血液相容性。

 

7. (a)PPGn-PILmMIC (b) PPGn-PILm的溶血结果


细胞实验结果表明,PPGn-PILm具有比相应均聚物更高的细胞毒性,这可能是因为它们的胶束形态提高了表面电荷密度,导致膜更易破裂。同时,正如前文所说,低分子量PPGn-PILm的聚集尺寸小,更易于细胞渗透以及细胞凋亡的发生,因此高分子量PPGn-PILm将具有更低的细胞毒性,如图8所示。结合抗菌效果可知,PPG34-PIL70同时具有高抗菌活性和低细胞活性,从而成为感染和抗菌涂层的最佳候选者。

8. NIH 3T3(a)293T(b)细胞用PPGn-PILm处理后的细胞活力


综上所述,作者证明可以通过在低极性溶剂(如DCM, TCM)中使用PPG-BA引发CPBLG-NCA开环聚合以及后续侧链修饰有效合成含咪唑鎓环的PPGn-PILm。同时,未纯化的NCA单体也可以在H2O/DCM二元体系中快速可控地聚合。PPGn-PILm采取α-螺旋构象,能够在水溶液中形成具有高抗菌活性的阳离子胶束,且抗菌活性与阳离子多肽链长密切相关。结合细胞活性和溶血实验,PPG34-PIL70在具有高抗菌活性的同时,还表现出对各种哺乳动物细胞系的良好亲和性。本文的工作为制备基于多肽的嵌段共聚物提供了一种简便的方法,所得的PPGn-PILm可以作为多功能用途的AMP模拟物。


作者QJC  审校LXY

DOI: 10.1021/acs.biomac.1c00126

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.1c00126


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