今天给大家分享一篇最近发表在美国国家科学院院刊上的研究，题为：Live-cell protein engineering with an ultra-short split intein，文章的通讯作者是普林斯顿大学的Tom Muir教授。
图 1 本文所报道的断裂内含肽
包含内含肽（intein）的蛋白能够发生蛋白质剪切（protein splicing），可从前体蛋白中将内含肽切除并将两侧的外显肽（extein）连接起来，形成成熟的蛋白。目前内含肽主要分为两类：第一类是其作为完整的片段嵌入到待成熟序列中，第二类则被称作断裂内含肽（split intein）,其首先需要将N端（IntN）与C端（IntC）两个片段发生组装，随后才能发生剪切将外显肽进行偶联。由于高效性并且偶联后两个片段间的间隔序列较短，基于内含肽的技术已经广泛的被应用于蛋白偶联以及化学生物学的研究中。
图 2 VidaL的体外偶联实验及其结构
在活细胞内将体外合成的片段与胞内合成的片段进行连接（即细胞内蛋白半合成）将为蛋白质结构与功能的研究提供更多的可能性，然而在此方向过去几十年一直没有取得有效的进展，一个主要的原因是传统的断裂内含肽片段较大，在合成方面具有挑战性的同时也限制了胞内偶联的效率。在本文中，作者使用了一种非经典的断裂内含肽，其靠近N端的片段仅为16个残基，可以较为方便的与人工合成的底物结合，同时能够进行高效偶联，利用该内含肽作者发展了在活细胞内的蛋白工程化技术。
该内含肽被称为VidaL，是对南极洲维达湖（Lake Vida）的生物样本进行基因发掘时发现的。体外实验显示（图2），N端（VidN）与C端片段（VidC）混合后能够高效地将外显肽进行偶联，1分钟后反应的转化率就达到50%以上，并且在不同的温度以及盐浓度下都能保持较高的反应效率。为了对两个片段的组装以及反应机理进行研究，他们对组装体的活性位点进行突变，并对复合物的晶体结构进行了解析（图2 D、E），结构分析显示，驱动VidN与VidC）的作用力主要是亲疏水相互作用，同时其-1位氨基酸必须是没有侧链的Gly。他们随后在大肠杆菌中进行了筛选试验，确定了靠近内含肽片段的序列要求。
图 3 macroH2A1.1-H2B的合成与表征
接下来作者计划使用该内含肽在体外合成有功能的蛋白，首先他们尝试了将可溶与不可溶的片段进行偶联。在传统方法中，不可溶蛋白的分离提纯方法往往与可溶蛋白不相兼容，而将不可溶与可溶的片段分别纯化后进行偶联可以对这一过程进行优化。他们选择了一种组蛋白的变体macroH2A，将其中不可溶的片段与VidN进行融合，表达后作者将其与组蛋白H2B进行共组装，得到了可溶的反应底物。再将其与融合有VidC的可溶片段混合后，作者成功地得到了目的蛋白（图3）。
图 4 细胞内含后修饰蛋白的合成与表征
体外实验成功后，作者期望进一步尝试细胞内的蛋白质半合成。他们计划在体外合成融合有VidN的多肽片段，将其递送到细胞内部，并与其中表达的含有VidC的另一片段进行偶联。他们仍旧选择了组蛋白作为研究对象，并在体外合成了带有甲基化修饰的组蛋白片段，通过电穿孔的方式将其运输到细胞内部，16小时后成功地在细胞中检测到了带有甲基化修饰的组蛋白整体；进一步的，他们也在细胞中合成了带有两种后修饰的组蛋白。功能实验结果显示，细胞内的偶联能够对蛋白的功能进行调控。
总结来说，作者利用内含肽VidaL成功地实现了具有挑战性的蛋白的合成，并可以在活细胞内原位半合成具有修饰的蛋白，该技术有望为深入研究含多种后修饰蛋白的功能奠定基础。
作者：Roy Wu 审校：ZRC
J. Burton, M. Haugbro, E. Parisi, T. W. Muir, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 12041-12049.
Link: https://www.pnas.org/content/117/22/12041
