大家好，今天为大家分享一篇最近发表在Nature Chemistry上的文章，Site-selective tyrosine bioconjugation via photoredox catalysis for native-to-bioorthogonal protein transformation。这篇文章的通讯作者是普林斯顿大学的David W. C. MacMillan教授。

近年来，化学修饰蛋白被广泛地应用于细胞追踪、成像、生物材料和药物治疗等领域。其中，生物正交偶联反应是构建生物杂交偶联物的一种强有力的方法。该反应首先需要将一个点击反应基团引入特定的底物如蛋白质上，目前常用的方法是通过基因工程引入非天然氨基酸来实现生物正交偶联，而一种更有吸引力的方法是直接在天然蛋白质上进行生物正交反应。

在过去的十年中，氨基酸特异性的生物偶联技术有了很大的发展，但是发展化学选择性和单位点选择性的偶联技术仍有较大的挑战。赖氨酸由于亲核性以及溶剂暴露性常用于蛋白质烷基化，但是它缺乏位点选择性；相比之下，半胱氨酸由于其较低的丰度是一种具有吸引力的偶联位点，但是半胱氨酸通常参与二硫键的形成，对半胱氨酸的修饰可能会破坏蛋白结构。而酪氨酸可以有效地避免上述问题，它在天然蛋白质的丰度较低，并且由于其两亲性，它既可以存在于蛋白质的内部，也可以暴露于溶剂之中，这使得它具有位点选择性；并且由于其苯环上丰富的电荷密度，酪氨酸也可以在氧化还原催化剂的存在下实现自由基偶联。

在本文中，作者设计了一种光氧化还原试剂3,7-二醛基吩噁嗪（图1a）。它是一种双功能化试剂，可以在光氧化还原催化剂的存在下对蛋白质中的酪氨酸进行特异性标记；并且醛基可以用于后续的生物正交反应，如生物素标记或者荧光标记，同时醛基的存在增强了N原子自由基的亲电性，使得其更容易与酪氨酸进行反应。

图1. a) 将位点选择性光氧化还原偶联与生物正交化学结合，可以直接得到结构明确的生物偶联物；b) 这种方式可以直接对天然蛋白进行化学修饰，无需非天然氨基酸的引入；c) 酪氨酸是进行蛋白单修饰的理想位点，由于其两亲性，其会存在于不同的微环境中，导致有不同的反应性

作者首先利用含有一个酪氨酸残基的小分子多肽药物比伐卢定（表1化合物3）作为模型底物进行反应条件的优化。在优化的条件下，该底物可以以95%的效率与二醛基吩噁嗪进行偶联。并且在没有光或者没有光氧化还原催化剂的存在下，该反应不能发生，表明该反应是通过单电子转移机理进行的。作者根据实验现象提出了一种可能的反应机理（图2）。

图2. 酪氨酸位点选择性胺化可能的反应机理

表1. 反应条件的优化

接着，作者评估了不同蛋白底物的反应性和转化效率。作者利用酪氨酸与二醛基吩噁嗪形成的偶联物的荧光来计算反应的转化效率，使用胰蛋白酶消化和蛋白质二级质谱（LC-MS/MS）来分析偶联反应发生的位点。结果显示，二醛基吩噁嗪不仅可以对单酪氨酸的多肽进行高效标记，并且还可以实现对含有多个酪氨酸残基的大分子量蛋白进行单位点标记。这主要是由于酪氨酸的两亲性使其存在于不同的微环境中。当其存在于蛋白质内部，或者形成阳离子-π相互作用时，由于空间位阻大或电子密度下降，导致其不能于二醛基吩噁嗪发生单电子转移过程，因此反应无法发生；而当酪氨酸羟基形成氢键时，苯环电子密度升高，有利于反应的进行。作者也证明色氨酸、甲硫氨酸等残基不会影响该反应的发生。

该光氧化还原偶联反应具有良好的生物相容性，作者使用圆二色谱对反应之后的蛋白质进行表征，结果表明蛋白质二级结构均未发生变化。不仅如此，作者还发现酪氨酸与二醛基吩噁嗪形成的偶联物可以发射荧光，这不仅可以用于计算反应转化效率，还可以在复杂环境如细胞中追踪蛋白质。

总之，在本文中作者利用光氧化还原催化剂，成功地实现了蛋白质酪氨酸位点选择性标记，并用于后续生物正交反应。该反应温和、高效，具有较好的生物相容性，并且对酪氨酸所处的微环境敏感，可以实现单位点标记。该技术是一种高效的天然蛋白质偶联策略，为形成结构明确的生物分子偶联物提供了新的思路。

作者：ZHS    审校：WLT

DOI: 10.1038/s41557-021-00733-y

Link: https://doi.org/10.1038/s41557-021-00733-y