生物正交反应作为化学生物学研究中的一类重要的分子工具，近二十年来极大地推动了生物分子示踪、蛋白质组学、代谢组学、药物递送等研究的发展。生物正交环加成反应是其中最为主要的反应类型，但已有的生物正交环加成反应往往采用张力烯烃或炔烃作为反应物，存在难于合成，稳定性差等问题。此外，现有反应种类有限，难以对复杂生理活动开展全面、系统的研究。因此，开发新型的生物正交环加成反应仍是当前研究中的一大热点。
近日，南京大学张艳教授团队和梁勇教授团队合作开发了一种基于邻二酮与当归内酯类化合物之间的新型生物正交环加成反应（DFC）。该反应无需催化剂、环张力、光诱导，利用水的高极性（介电常数78.5）来稳定烯基氧负离子，作为一个极为富电子的环加成基团，使其可以与基态邻二酮快速发生反应。该项工作的创新之处在于，结合理论计算与实验验证，首次提出了阴离子可以通过显著增强过渡态分子间的静电作用加速环加成反应在水溶液中的动力学，并且由于该反应与经典的环张力诱导的叠氮与炔烃的环加成反应（SPAAC）、逆电子需求的Diels-Alder反应（IEDDA）具有不同的反应机制，利用这三种反应可以实现对同一体系中不同蛋白质或细胞的三重正交标记，为同时研究复杂体系中的多种生物大分子提供了新的策略。
张艳教授团队前期的研究结果表明激发态邻二酮与富电子的非张力烯烃能发生环加成反应（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 14542-14546）。梁勇教授团队利用量子化学计算对基态邻二酮PQ与一系列烯烃和炔烃的环加成反应活性进行了预测。计算结果表明，α-当归内酯α-AL与邻二酮PQ的环加成反应能垒高达33.7 kcal mol-1。而α-AL的共轭碱S2可作为阴离子环加成物与PQ反应，速率常数可高达7.3×105 M-1 s-1。考虑到α-AL的pKa约为12.1，在pH=7.4的缓冲溶液中，PQ和α-AL经由阴离子S2的环加成反应速率常数计算预测可达14.8 M-1 s-1。 实验结果表明，室温下邻二酮PQ与α-AL在苯、氯仿等有机溶剂中不反应；在pH=7.4的缓冲溶液中测定的速率常数为10.7 M-1 s-1。这些结果与理论预测都相符。邻二酮oD1与α-AL的环加成反应速率随着反应体系pH的增加而加快，这也进一步证明了实际的环加成反应物为α-AL的共轭碱S2。同时，根据理论计算结果，PQ和α-AL对叠氮化合物、张力烯烃，如反式环辛烯（TCO）和张力炔烃，如二苯并氮杂环辛炔（DIBAC）都是惰性的。基于此，理论计算表明，DFC与SPAAC和IEDDA可作为新的三重正交环加成反应对。 实验上，将菲醌基团oD1共价标记在SNAP-GFP融合蛋白的特定单个位点，再加入蛋白质1.5倍当量浓度的FuA-TAMRA与之反应，蛋白质二级质谱检测到了反应的成功发生，并且反应在4分钟内即可完成。由此说明了DFC反应在大分子上仍具有很高的反应效率。此外，将oD1或FuA基团分别标记在细胞膜表面的聚糖或蛋白质上，并进一步利用DFC反应实现了对细胞膜的荧光标记，标记反应在10分钟内即可完成。 作者进一步将DFC反应与SPAAC、IEDDA反应同时用于同一体系中不同研究目标的正交标记。将不同反应的生物正交基团分别修饰在三种模型蛋白或三种模型细胞上，再与相匹配的另外三种修饰了荧光基团的生物正交官能团于同一试管中混合，胶内荧光分析及流式细胞术对蛋白质或细胞的荧光标记信号分析结果均显示，利用DFC、SPAAC、IEDDA这三个反应可以成功实现同一体系中三种蛋白或三种细胞的正交标记。 总之，本文所开发的邻二酮与当归内酯类化合物的生物正交环加成反应，与经典的张力促进的生物正交环加成反应相比，具有完全不同的反应机制，从而可与SPAAC反应、IEDDA反应共同用于生物分子或细胞的正交标记。这一反应的设计与开发，为发展新型的生物正交反应提供了新的策略，并有望与其它的生物正交反应相结合用于研究复杂的生命体系。 论文信息 Metal- and Strain-Free Bioorthogonal Cycloaddition of o-Diones with Furan-2(3H)-one as Anionic Cycloaddend Ziwei Xi,Hao Kong,Yu Chen,Jiafang Deng,Wenyuan Xu,Prof. Dr. Yong Liang,Prof. Dr. Yan Zhang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202200239
