有机定制合成网

上海凯康镁科技有限公司 电话:021-51009326 化合物定制询价
专注化合物定制合成服务

Nature Chemical Biology | 细菌聚糖中呋喃核糖的生物合成来源

推荐一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章,文章标题是The biosynthetic origin of ribofuranose in bacterial polysaccharides。其通讯作者是加拿大圭尔夫大学分子和细胞生物学系的Matthew S. Kimber教授和Chris Whitfield教授。Matthew S. Kimber教授旨在用单晶X射线衍射解析细菌的蛋白结构,理解细菌产生多样性的细胞表面聚糖的机制及细菌微区室的结构和功能。Chris Whitfield教授旨在揭示致病细菌表面的结构和组装。在本文中,以肺炎克雷伯菌O-抗原多糖为模型,用于鉴定催化两步反应序列的双结构域核呋喃糖基转移酶蛋白。磷酸核糖基-5-磷酸-D-核糖基-α-1-二磷酸作为磷酸核糖基转移酶(gPRT)的供体,然后磷酸核糖基磷酸酶(PRP)除去残留的5′-磷酸基。来自Thermobacillus composti的双结构域核糖基转移酶同源物的2.5-Å分辨率晶体结构揭示了PRP结构域,该结构域保留了卤酸脱卤素酶家族磷酸酶成员的许多特征,以及一个gPRT结构域,其与所有先前表征的磷酸核糖基转移酶有很大不同。gPRT代表了一种新的糖基转移酶折叠,在最丰富的核呋喃糖基转移酶家族中保守。

1


细菌表面有着许多聚糖发挥着重要功能,包括防止噬菌体的侵袭和抵御宿主的免疫系统。尽管脂多糖 (lipopolysaccharides, LPSs) 和磷壁酸是革兰氏阴性菌或阳性菌特有的,一些聚糖家族如荚膜的和分泌型的细胞外聚糖是革兰氏阴性菌和阳性菌共有的。细菌聚糖的多样化来自于拥有许多种单糖(包括未真核生物中发现的糖)、不同的糖苷键和非糖侧链。

糖单元通常通过糖基转移酶 (glycosyltransferase, GT) 整合进入聚糖中,GT可以界定糖供体的立体构型 (α/β) 和受体的连接位置。GT存在于所有形式的生命中并在CAZy (Carbohydrate-Active Enzyme) 数据库中有超过100个家族。大多数细菌GT利用核苷酸或二磷酸核苷连接的糖供体,含有罗斯曼折叠结构域整合进两个折叠 (GT-A, GT-B) 之一。其他GT利用聚戊烯醇连接的供体,整合进膜蛋白 (GT-C)。

尽管大多数常见聚糖中糖的生物合成和整合所需的基因和酶已被确认,呋喃核糖 (ribofuranose, Ribf的糖供体尚不明确。二磷酸腺苷呋喃核糖 (Adenosine diphosphoribofuranose, ADP-Ribf之前被提出是合成含Ribf的肺炎链球菌的荚膜多糖的糖供体。但ADP-RibfRibfC5位被活化,而糖苷键是在C1位反应形成的。并且,肺炎链球菌的基因座对于大肠杆菌中含RibfLPS O-抗原的产生不具有保守性。这表明用于Ribf前体合成的酶可能由未相连的基因编码,与早期的假设一致,该假设提出了一种来自中心代谢的未特异前体用于合成含有Ribf的沙门氏菌T1抗原。此外,最近研究提出,在一些志贺氏菌O-抗原血清型中加入Ribf需要一种来自核苷酸代谢的类似于磷酸核苷酸转移酶 (phosphoribosyl transferases, PRTs) 的预测蛋白质。这表示5'-磷酸-D-核糖基-α-1-二磷酸 (5′-phospho-D-ribosyl-α-1-diphosphate, PRPP),生物合成核苷酸、辅因子和一些氨基酸中的保守代谢中间体。这些想法没有在多糖生物合成中进行实验验证。然而,RibfPRPP转移到另一种单糖在2-脱氧-D-链球菌胺 (neamine) O-核糖基化以形成核糖霉素中得到了明确的证明。这是通过PRPP依赖性PRT和专用磷酸酶催化的两步反应实现的。PRPP还可作为聚戊二醇-单磷酸阿拉伯糖供体形成的前体。在这些细菌中,5'-磷酸核糖基-单磷酸聚戊二酚中间体被去磷酸化和异构化以产生阿拉伯糖供体,其翻转过膜实现受体的糖基化。

本研究的目的是以肺炎克雷伯菌O-抗原为原型,明确解决多糖生物合成中Ribf转移的化学。本研究报告了两步PRPP依赖的反应序列的生化表征,该序列在Ribf转移酶的主要组中是保守的,以及含有5′-磷酸核糖基磷酸酶 (phosphoribosyl-phosphatase, PRP) PRT催化模块的双结构域聚糖Ribf转移酶的结构。这些酶的同源物形成了已知Ribf转移酶最丰富的家族,并鉴定出新的GT折叠。

首先,比较肺炎克雷伯菌O4和O7基因簇。

选择肺炎克雷伯菌血清型O4O7 LPS O-抗原多糖作为模型系统研究聚糖中Ribf的酶来源。RibfO4O7聚糖的重复单元骨架中唯一共享的单糖 (1)。克雷伯菌O-抗原作为十一碳烯醇二磷酸连接中间体在细胞内聚合,然后通过ATP结合盒 (ATP-binding cassette, ABC) 转运蛋白 (WzmWzt亚基组成从细胞质膜到周质。之后,多糖转移到LPS的脂质A核组分,完整分子易位到细胞表面。编码GTs (可能包括Ribf转移酶和合成特定多糖的供体底物所需的酶的基因在相应的基因簇中被发现,而用于生产同样用于持家的细胞过程的前体的基因通常位于其他地方。除了WzmWzt,克雷伯菌O4O7基因簇仅编码一个同源物ORF5KpO4ORF7KpO7,它们共享22%的相同和30%的相似。我们假设这些蛋白参与Ribf的掺入。ORF5KpO4 ORF7KpO7与核糖霉素生物合成中的PRPP依赖的PRT (BtrL) 和磷酸酶 (BtrP) 没有显著的相似性,与结核分枝杆菌的聚戊二醇-PRT (Rv3806c) 和磷酸酶 (Rv3807c) 也无显著相似性。保守结构域数据库预测两种克雷伯菌蛋白的N末端卤酸脱卤素酶 (haloacid dehalogenase ,HAD) 结构域。HAD超家族以磷酸根操纵酶为主,包括磷酸酶。ORF5KpO4 ORF7KpO7C端是高度保守的,它们与任何已知的GT或参与活化供体合成的酶没有可检测的相似性。

2

图1 肺炎克雷伯菌O4和O7抗原的重复单元结构和指导其生物合成的基因座


第二,ORF5KpO4 ORF7KpO7是双功能的Ribf转移酶。

为了确定酶功能,基于受体底物设计了体外反应,O7 (1) O4 (2) 重复单元的片段连在甲氧基苯甲酰胺配体上(2)。在基因座内缺乏用于合成潜在供体的基因,PRPP被选为候选者,由于PRPP1-焦磷酸根可能提供适当的离开基团而Ribf-5-P将被转移到受体。在这种情况下,末端5'-磷酸根可能会干扰下一个糖向聚糖的转移,并且其去除为HAD结构域的存在提供了解释。来自含有纯化的ORF5KpO4ORF7KpO7的体外反应产物采用高效液相色谱 (HPLC) 和质谱法进行分析。每种酶将其同源受体转化为新产物 (2)。主要的 [M+H] 离子峰值m/z值为704.34 (ORF7KpO7 722.32 (ORF5KpO4与戊糖的添加一致 (Ribf mass, 132)。这些结果表明ORF5KpO4ORF7KpO7作为PRPP依赖的Ribf转移酶,完成Ribf-5-P的添加和5′磷酸根的去除。

为了确定反应顺序,催化残基 (ORF7KpO7中的D28ORF5KpO4中的 D10) 通过组合序列和预测的二级比对已确定的HAD磷酸酶进行鉴定,并用丙氨酸代替。纯化ORF5KpO4-D10AORF7KpO7-D28A蛋白催化同源受体转化为与野生型酶不同的产物 (2)。质谱分析揭示了主要的 [M+H] 离子峰的m/z值为782.31 (ORF7+KpO7-D28A800.28 (ORF5KpO4-D10A),与Ribf-5-P (质量212) 12之后 (在野生型酶中)去磷酸化一致。此外,数据还表明Ribf转移酶由两个催化结构域组成:受体特异性PRT (gPRT,其中g代表聚糖,将这些酶与参与其他细胞过程的PRPP依赖性PRT区分开和属于HAD家族的PRP

 

第三,酶gPRTPRP可以在聚糖组装中作用于反式。

为了研究gPRTPRP酶是独立折叠结构域的可能性,PRPKpO7PRPKpO4结构域在结构域连接环内的等效位置切除。纯化这些结构域 (残基1-2161-214)并在两步反应序列中研究其活性,从用ORF5KpO4-D10AORF7KpO7-D28A转移Ribf-5-P残基到化合物12。在其中加入同源的反式PRP导致完全去磷酸化 (2a, b)。之后研究PRP的特异性。两种酶都去磷酸化了异源受体分子上的Ribf-5-P残基,尽管相对于天然底物的速率降低 (2)

3

图2 ORF5KpO4 ORF7KpO7中gPRT-PRP活性的生化表征


第四,嗜热菌Ribf转移酶的结构。

为了更好地了解聚糖核呋喃糖基化的生化基础,我们试图确定克雷伯菌蛋白的结构。尽管进行了很多努力,但都没有结晶。然而,从嗜热革兰氏阴性菌T. composti DSM 18247 (ORF4Tc中鉴定出一种同源物。ORF4TcORF7KpO7ORF5KpO4具有23/25%的相同和40/42%的序列相相似性。这三种蛋白质显示了PRPgPRT结构域中的序列保守区域。在T. composti基因组中,orf4Tc与其他多糖合成基因 (包括wzm/wzt相邻,但对应的聚糖结构未知。

对于克雷伯菌酶,ORF4Tc有大约140个残基的C端延伸,并且在大肠杆菌K-12中表达时定位于膜上。可溶的截断形式 (ORF4Tc 1-626简称ORF4Tc),在所有后续实验中使用。ORF4Tc在体外的12无活性,可能反映了由未知的T. composti聚糖引起的不同受体要求。C端截断ORF4Tc预计不会影响保守的gPRT活性位点。ORF4Tc也不太可能转移另一种糖,鉴于其预测的PRPP结合位点的精细细节的保守性以及结合该底物所需的特殊要求。当ORF5KpO4-D10A用于含有2的反应合成具有末端Ribf-5-PORF4Tc使产物去磷酸化。因此,ORF4TcPRP结构域(至少)是折叠和活跃的。

ORF4Tc产生衍射至2.5-Å分辨率的晶体,并使用AlphaFold构建的搜索模型通过分子替换确定结构。尽管分辨率适中且存在强烈的平移非晶体对称性 (这使得分子替代复杂化),但该策略还是有效的。在不对称单元中有两个基本相同的分子,但ORF4Tc是基于尺寸排阻色谱的单体。ORF4Tc在概念上可以分为两个α/β罗斯曼折叠域,并辅以三个结构上不同的α螺旋结构域 (3)N端区域 (残基7-242) 形成PRP结构域,而C端形成更大的gPRT结构域 (残基243-597)。这些结构域掩埋了1037 Å2,但界面主要是亲水性的。


4

图3 ORF4Tc的结构


第五,PRP模块是HAD超家族的成员。

PRP结构域类似于其他HAD-结构域结构,并且围绕罗斯曼折叠模体构建,具有中央五股β-sheet,两侧的每个面上有两个α螺旋 (图4a)。在罗斯曼折叠的第一个α/β链重复之间插入四个α螺旋,构建1型HAD家族蛋白的帽亚结构域特征。一个额外的螺旋 (Nα9) 将PRP连接到gPRT结构域。DALI搜索显示所有结构类似物都是HAD结构域家族的成员。最接近功能表征的同源物包括人环氧化物水解酶和HAD,Z得分均为16.2。具有已知磷酸酶活性的最相似的结构包括人酶烯醇化酶磷酸酶1和计时蛋白 (使磷酸吡哆醛和共纤素脱磷化),Z得分分别为14.9和14.6。综上,ORF4Tc的罗斯曼结构域与其他HAD结构域成员非常相似,而帽限域更发散。

PRP活性位点在由罗斯曼结构域构建的细长口袋中,帽结构域和α9螺旋与口袋邻近。使用Consurf将保守序列映射到结构上 ( 4b) 显示这个口袋内的几乎所有残基都是绝对保守的。PRPTc活性位点口袋保留了许多已知对HAD磷酸酶中的磷酸根识别和催化很重要的特征 (4d)。尤其,单个Mg2+Asp16Asp205羧酸根、Phe18羰基氧和三个水分子在近似的八面体几何形状中协调 (4c)Mg2+通常在HAD磷酸酶中起着至关重要的作用,PRPKpO7同样被证明Mg2+依赖。通过与其他HAD磷酸酶类比,5′-磷酸根应协调Mg2+,以及氢键Lys180 Nε (HAD磷酸酶中绝对保守)Ser145 OH (保守为Thr / Ser) Asp146Ile17Phe18的酰胺氮原子。HAD磷酸酶通过酰基-酶中间体起作用,并且该机制的关键决定因素似乎也是保守的。Asp16是预测的亲核试剂,攻击底物的磷酸根部分,核糖作为离去基团。

糖结合的决定因素不太确定,尽管残基保守表明底物沿着口袋表面结合。一系列四个表面暴露的芳香族残基 (Phe18, Phe147, Tyr148和Phe76) (图4b, c) 是保守的 (通常为F/Y),并呈现一个扩展的非极性表面用于与底物糖内的非极性模体相互作用。因此,我们试图将带有末端Ribf-5-P的O4二糖重复单元建模到PRPTc中 (图4d, e)。将磷酸基置于其保守的口内,核糖基团很容易地堆叠在Phe147的边缘,O3与绝对保守的Arg24形成氢键,O2具有结构化的水分子。β-(1→4)连接的Galp在Tyr148环上堆叠C3、C4、C5和C6,与Glu29(O2)、Lys32(O1)和Glu75(O6)具有氢键。虽然其他糖底物可能利用不同的相互作用,但双糖主要填充口袋,表明特异性主要由两个非还原的末端残基决定。Ribf-5-P似乎是更重要的决定因素,与PRP结构域水解非同源性底物的能力一致。

5

图4 ORF4Tc的N端PRP结构域的结构


第六,gPRT结构域代表了一种新的GT折叠。

gPRT结构域结构围绕着一个中央的五股罗斯曼折叠结构域构建,两侧是两个α螺旋在相对的面上堆积 (图5a)。这个核心罗斯曼模体辅以两个额外的亚结构域。在链β2和β3之间插入六螺旋亚结构域 (残基327-431);我们将其称为“hood”结构域。在层的另一面,两个额外的N端 (残基243-286) 和五个额外的C端α螺旋 (残基482-597) 共同形成一个延伸罗斯曼结构域的base亚结构域。此亚结构域打包在PRP结构域上并扩展了β功能区模体,该模体从hood结构域与α9交互。使用带有DALI的gPRT结构域搜索PDB表明,所有最接近的结构类似物都是核苷酸PRT。然而,这些蛋白质是非常遥远的类似物;且最接近的,兰伯氏贾第鞭毛虫鸟嘌呤PRT,Z评分为7.1,仅共享8%的相同序列,跨越 157 个残基,叠加在罗斯曼结构域的核心上,均方根偏差为3.5 Å。这表明gPRT结构域与其他PRT具有共同的祖先,但已经大大分化并获得了独特的结构特征。

PRT活性位点位于β1β3末端之间的罗斯曼结构域的缺口处。Consurf揭示了一个以该部位为中心的强保守的扩展口袋,但延伸到hoodbase亚结构域的近端部分 (5b, c)Toxoplasma gondii次黄嘌呤-鸟嘌呤PRT (HGPRT) 的三元复合物提供了一个有用的模型,说明gPRT如何识别PRPP ( 5d)

为了测试该模型,我们在GprtKpO7的结合位点中突变了关键残基。ORF7KpO7中的残基R284 (相当于ORF7Tc R296)D285 (E297)R311 (R329) D417 (D438) 分别改为丙氨酸;热熔曲线表明所有变体都折叠。R284A (R296) R311A (R329) 突变蛋白无活性,而D285A (E297) D417A (D438) 显示出显著降低活性。这些结果与我们提出的底物结合模型一致;Arg296Arg329是结合PRPP的重要决定因素,Glu297是结合 (并可能激活末端受体残基的重要决定因素。相比之下,Asp438似乎在核糖结合中起着部分可有可无的作用,尽管它是在HGPRT活性位点中具有直接等效物的唯一残基。

6

图5 ORF4Tc的C端gPRT模块的结构

第七,ORF7KpO4ORF7KpO7ORF4Tc代表一个酶家族。

为探究肺炎克雷伯菌和T. composti酶的活性和结构特征在其他细菌中产生含Ribf的糖缀合物时是否保守。基因数据库检索受到gPRT模块缺乏相似性的挑战。tBLASTn使用gPRTPRP或全长蛋白进行搜索,所有结构都具有低相似性 (大多数低于35%, e值范围为10−24–10−4),但大多数来自未表征的系统,因此不能与含Ribf的多糖建立可信的相关性。为了规避这种情况,从糖结构数据库中选择了不含Ribf的聚糖并且 (在可用的情况下直接检查来自特定菌株或血清型的基因组数据的相应生物合成基因座,以查找编码gPRTPRP蛋白的基因。总共有34种含Ribf的聚糖与来自17个独特属的基因座相匹配。在多个属中发现了一些聚糖,导致总共收集了41种候选蛋白。所有位点都编码推定的PRP,表明两步反应是含Ribf聚糖的生物合成的普遍特征。

41个检索到的序列中,有21个类似于克雷伯菌和T. composti原型。这些酶中PRP的同源性清晰可辨 (BLAST e值范围从1.15×10−398.65 × 10−07),关键活性位点残基强保守。尽管它们的总体序列相似性较低,但相应的gPRTs共享保守部分,其中包括基本催化残基。AlphaFold建模为一些代表证实了保守的整体架构。最明显的差异涉及在该区域的base亚结构域内插入或删除螺旋,紧邻gPRT活性位点,可能反映了对不同受体底物的识别。我们将这些酶称为第1Ribf转移酶,它们参与革兰氏阳性和阴性细菌的各种糖结合物的合成,反映了用于细菌聚糖的两种主要组装策略。

在第1组酶中,双结构域蛋白,如克雷伯菌,代表了最常观察到的组织。然而,一些蛋白质参与通过ABC转运蛋白依赖性过程组装的荚膜多糖的聚合拥有更复杂的模块化架构。例如,流感嗜血杆菌血清型b聚糖具有由Ribf和磷酸核糖醇组成的双糖重复单元,相应的遗传座编码一种酶,该酶将NCDP-核糖醇依赖性核糖醇-磷酸转移酶与C gPRT/PRP 结构域相结合。大肠杆菌K13K23荚膜多糖由Ribfβ连接的3-脱氧-D-甘露糖-oct-2-乌洛糖酸 (β-Kdo) 组成。N端结构域可能代表生产聚合物所需的Kdo转移酶,尽管它们与已知的β-Kdo转移酶没有相似之处。在一种情况下,PRPgPRTs是单独多肽的一部分。

 

第八,一些细菌中Ribf转移酶的结构独特性。

目录中的其余示例具有可识别的PRP同源物。然而,与其他HAD蛋白的低相似性导致大多数缺乏注释或在基因组序列中被错误注释。这20个代表的位点都缺乏编码与第1组原型相关的gPRT的基因。

在六种情况下 (指定的2Ribf转移酶),该位点编码具有CPRPN端结构域的双结构域酶,该结构域显然与常规1PRT同源。这在核苷酸的合成中得到了很好的记录。所有六种都与由Wzx/Wzy依赖性策略组装的LPS O抗原相关。

其余条目的遗传位点具有PRP模块的基因,但缺乏与第1组或第2gPRT同源的基因。它们分为两个序列组,每个组中的例子共享广泛的同一性/相似性,但它们在顺序上完全不同,以排除对齐。12个实例通过Wzx/Wzy依赖性机制参与O-抗原合成,并且所有Ribf都转移到受体GalGalNAcGalA残基。其余两个条目来自ABC转运体依赖系统。需要进一步研究以确定负责这些细菌中初始Ribf-5-P转移的成分。

 

综上所述,本文鉴定细菌多糖中Ribf残基的活化前体为PRPP,两步反应序列将这些酶与CDP-核糖醇和CDP-甘油依赖性转移酶区分开来。来自T. compostiPRPP依赖性gPRT模块的结构,结合底物建模和克雷伯菌原型的突变分析,揭示了PRT酶修饰非甘聚糖底物的共同祖先。然而,它们也具有明显的结构特征,可能反映了对聚糖基底物的适应。识别Ribf供体并了解潜在的酶学对糖工程具有重要意义。


文章作者:LYJ

DOI:10.1038/s41589-022-01006-6

责任编辑:LD

收录于合集 #Spotlight
 193
上一篇课题组工作|RSC Chem. Bio. | 用于生物分子时空标记的光引发化学报告基团策略下一篇Journal for ImmunoTherapy of Cancer|卡介苗表面展示FimH靶向甘露糖,改善膀胱癌的免疫治疗



有机定制合成网 » Nature Chemical Biology | 细菌聚糖中呋喃核糖的生物合成来源

咨询化合物定制合成与纳米材料 提供技术支持和售后服务

咨询定制合成 购买化合物产品
在线营销
live chat
no cache
Processed in 0.639370 Second.