基于邻近激活的DNA编码扫描测序技术用于膜蛋白纳米结构的大规模解析

分享一篇发表在PNAS上的文章，文章题目为“Proximity-activated DNA scanning encoded sequencing for massive access to membrane proteins nanoscale organization”，本文通讯作者为西安交通大学的赵永席教授和赵越副教授、吉林大学化学院的孙颖教授。前两位老师课题组的主要研究方向是高通量单分子与单细胞分析、核酸化学与生物学、功能纳米材料与分子探针和微流控芯片；孙老师课题组的主要研究方向是生物化学传感分析、传感器界面组装与修饰、微生物检测。

膜蛋白在动态纳米环境中表现出显著的多样性和精确的定位。传统的方法受限于有限的蛋白质种类和空间覆盖范围，阻碍了对膜蛋白的全面分析，本文作者开发了一种名为proximity-a ctivated DNA scanning encoded sequencing（PADSE-seq）的方法，可以用于膜蛋白分布的大规模分析。

该方法的原理如下：固定在靶位点（T0）上的DNA扫描探针（SP）初始处于封闭状态，需由切刻内切酶激活。激活后，SP能识别并依次激活其可接触范围内的相邻位点（P1、P2、P3……Pn）上的DNA条形码探针（BP）。由于切刻内切酶仅切割一条DNA链，SP可经历多轮“杂交—切割—释放”循环，从而逐步激活所有邻近的BP。被激活的BP与带有不同分子ID的模板探针（TP）结合，触发聚合酶延伸并生成切刻内切酶识别位点，继而触发SDA反应，释放出同时含有蛋白ID和分子ID的编码产物。最终通过PCR和NGS对这些产物进行分析，从而获取膜蛋白的空间分布信息。

为了验证该设想的可行性，作者先证明了使用切刻内切酶在溶液中连续激活BP的可行性，他们设计合成了用不同荧光团标记的探针SPsol、BPsol-Cy3和TPsol-Cy5，用PAGE分析每一步反应的产物，实验结果表明每一步的产物均符合预期。之后作者使用序列长度或者序列作为条形码来区分不同类型的BP，证明了PADSE-seq可以识别和激活BP并产生相应扩增产物。

作者设计了两种DNA折纸结构（SD1和SD2），用于模拟细胞膜蛋白在纳米尺度上的空间分布差异。每个BPori探针包含两个部分：用于标识蛋白种类的条形码序列（蛋白质ID）以及一个30碱基的随机序列（分子ID），后者用于追踪和统计测序中每个分子的来源。在中心位点固定的SPori激活下，BPori探针通过SDA反应将蛋白质ID与分子ID连接，并经PCR扩增后进行高通量测序。对比分析发现：在SD1中，三种蛋白质ID对应的条形码在测序结果中均有显著出现；在SD2中，原位于第一圈的探针被另一种具有相同蛋白ID的探针替代后，ID2的条形码显著减少，而ID1的条形码比例上升。进一步对前6个碱基（即蛋白质ID）进行统计分析，显示出与探针空间分布相一致的条形码比例变化。结果表明，测序信号与探针的空间位置高度相关，验证了该方法在解析复杂膜蛋白邻近关系方面的可行性。