推荐一篇发表在JACS上的文章，题目为“Macrocyclic Phage Display for Identification of Selective Protease Substrates”，通讯作者是来自斯坦福大学Matthew Bogyo与Marta Barniol-Xicota，他们课题组的研究方向是多肽药物及探针开发和化学蛋白质组学。

蛋白酶在正常细胞功能以及许多病理状况中起着至关重要的作用。因此，它们是治疗和诊断药物的宝贵靶标。对于大多数应用，需要高选择性底物来区分目标蛋白酶和具有相似活性位点结构的同源酶。在已有的筛选底物肽的方法中，噬菌体展示技术以其极高的通量脱颖而出，但目前大多数的应用集中在线性底物的筛选中，其构象的多变性使得其容易发生脱靶蛋白水解，所以本文作者希望发展一种环肽的噬菌体展示筛选技术来选择性地筛选蛋白酶的特异性水解底物。

作者利用1,5-二氯-2,4-戊二酮（DPD）对噬菌体pIII外壳蛋白上的线性肽（AACX₇CG序列）进行共价环化，形成环肽结构。之后，二酮官能团与蛋白酶底物接头的末端肼发生正交的Knorr-吡唑环化，即可形成最终的大环蛋白酶底物文库。研究者可以更换肼连接的不同官能团来实现不同蛋白酶的底物筛选，如将脯氨酸识别位点连接到肼片段上即可靶向人成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）和二肽基肽酶-4（DDP4），之后串联生物素标签即可实现对噬菌体展示文库的富集和鉴定，串联荧光报告基团即可读出蛋白酶引发的酰胺键断裂。具体而言，就是只有靶向相应氨基酸连接臂的蛋白酶才可以将环肽从链霉亲和素的固相载体上释放下来，利用蛋白酶切割特定序列的作用将与蛋白酶有特异性亲和力的环肽释放下来测序从而读出目标环肽。

之后，作者希望将这种方法应用在蛋白酶特异性的底物环肽筛选上。作者针对序列同源性达68%的S9蛋白酶家族（含FAPα、DPP4、DPP9、PREP）进行了五轮渐进式筛选，首先通过将各个蛋白酶浓度从90 nM（FAP）和30 nM（DPP4）逐轮降至10 nM（FAPα）和5 nM（DPP4），施加动力学压力筛选出了高亲和力底物。通过富集分析，作者将FAPα的底物分为6类结构簇，DPP4底物归为7类结构簇。最后作者合成了对于这些酶有特异性亲和力的环肽分子，并筛选得到了FAPα有特异性亲和力的FAP-33环肽和对DPP4有特异性亲和力的DPP4-10s环肽，相对于商业化的蛋白酶指示剂展现出显著更强的特异性。

总之，本文发展了一种蛋白酶环肽底物的噬菌体展示平台，可以高通量地用于蛋白水解酶的特异性环肽底物，对于多肽药物及探针的发展具有重要启示意义。

本文作者：LYC

责任编辑：MB

DOI：10.1021/jacs.5c04424

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c04424