蛋白质编辑新策略：活细胞中位点特异性的酰基重排反应用于骨架延伸

分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目为“Site-selective protein editing by backbone extension acyl rearrangements”，通讯作者是来自UC Berkeley的Alanna Schepartz教授和Matthew B. Francis教授，研究方向分别为尝试利用核糖体生物合成化学聚合物以及利用细胞骨架蛋白进行药物递送；来自耶鲁大学的Scott J. Miller教授，研究方向为立体化学合成。

常规多肽主链骨架以α构型为主，而其他非α主链多肽或蛋白例如β、γ、σ等构型能够增加酶解稳定性和促进细胞通透性等，更适合于某些应用场景。但目前这些非经典多肽或蛋白通常难以在细胞中使用遗传密码子拓展技术进行生物合成，仅有少数实例通过核糖体体外翻译系统实现这类非天然多肽的合成。在此，文章报道了一种基于分子内酰基重排反应的活细胞新型位点特异性蛋白质编辑策略。

作者从天然化学连接技术（NCL）中获得灵感，当蛋白骨架上反应性较强的亲电集团（酯键、硫酯键）与侧链亲核基团氨基在空间上邻近时，会发生分子内重排反应。基于此，作者通过正交的氨酰tRNA合成酶——吡咯赖氨酰tRNA合成酶（PylRS）将侧链含有隐蔽基团的α-羟基酸单体引入翻译得到的蛋白质中，随后通过光脱笼或者化学脱笼方法使羟基酸侧链的亲核基团得以暴露，随后发生热力学上有利的分子内主链延伸酰基重排反应（BEAR），该反应能被用于生成含有β、γ和σ主链的多肽和蛋白质。

接下来，作者首先基于密度泛函理论评估了这种主链上酰基重排反应所需的能量，发现对于几种不同长度侧链的酯键和硫酯键骨架而言，它们反应后的酰胺形式处于的能垒更小更加稳定，即它们在热力学上有利发生。随后利用短肽在体外条件下测试了酯键和硫酯键的反应效率，发现硫酯底物的重排反应受到水解的干扰，而酯键则呈现出更好的结果。

随后，作者将上述策略应用到GFP的活细胞编辑中，首先分别测试了不同种类的大肠杆菌底盘接受掺入非天然氨基酸的能力，并通过质谱等方式确认了掺入叠氮保护羟基酸的蛋白成功表达，且分子量正确。随后，作者利用不同的化学还原剂进行叠氮掩蔽基团的脱笼处理，通过GluC酶解消化，在质谱上解析包含插入位点的肽段结构，最终优化出在pH为8.2条件下使用PTA作为还原剂能够得到产率最高的γ-骨架蛋白产物。通过LC共流出和MS2离子比对，作者再次确认了该分子内重排反应成功发生。