壳多糖(chitin)是广泛存在于自然界中的一种含氮多糖类生物高分子，主要来源于虾、昆虫等甲壳类动物的外壳和真菌类的细胞壁，蕴藏量占地球上所有天然高分子第二位。其降解成分葡萄糖胺(GlcNH2)是许多生物工程产品，如唾液酸衍生物的前体。
目前壳多糖主要是通过化学-酶法进行代谢 (Scheme 1)。首先壳多糖解聚得到乙酰葡萄糖胺(1)，随后酶解得到葡萄糖胺(2)。葡萄糖胺再经过N-酰基化、异构化、聚合等反应生成糖类生物工程产品。但是由于缺乏特异性的N-酰基化酶，从2转变成3这一步只能依赖于化学手段，且反应条件苛刻，需要活化的有机酸、化学计量偶联剂和保护基团。对于自然界是否存在催化葡萄糖胺N-酰基反应的生物催化剂，仍有待确证。
Scheme 1.Current chemo-enzymatic cascades forthe conversion of chitin from biomass to complexglycoconjugates.
最近，南京农业大学糖组学和糖生物工程研究中心Josef Voglmeir教授(Fig. 1)课题组在Angew. Chem. Int. Ed.上发表最新研究成果，首次鉴定了能够特异催化葡萄糖胺发生N-酰基化的蛋白CmCDA，该酶具有较好的底物宽泛性。这一发现打通了以壳多糖为起始，经过葡萄糖胺生物全酶法生产唾液酸苷衍生物的整条通路。Josef Voglmeir教授课题组长期致力于食品/营养糖组、糖生物学与工程、糖化学研究。
Figure 1.Professor Josef Voglmeir.
在没有催化葡萄糖胺N-酰基化候选酶的情况下，研究人员从寻求已知生物催化剂的杂泛活性入手。该课题组曾报道一个壳多糖去乙酰化酶CmCDA，它能特异催化N-酰基葡萄糖胺发生去酰基化。研究人员推测保守氨基酸残基His-His-Asp锌结合三联体稳定N-乙酰基，组氨酸和天冬氨酸分别作为广义酸和碱催化形成四面体含氧阴离子，从而发生去乙酰化(Scheme 2)。依据此机制，研究人员假设CmCDA应该能够催化去乙酰化的逆反应-N-酰基化。
Scheme 2. Proposed N-acylation mechanism of glucosamine by CmCDA.
于是研究人员将5当量的乙酸(3)、丙酸(4)、丁酸(5)、己酸(6)、叠碳乙酸(7)、羟基乙酸(8)、巯基乙酸(9)分别与CmCDA、葡萄糖胺(1)进行孵育(Table 1)，果然能生成相应的N-酰基化合物2和10-15。同样的反应条件，CmCDA却不能接受苯甲酸作为羧酸供体，可能是酶对大基团芳香有机酸的空间和电子限制有关。反应需要过量羧酸是由于加入等当量的有机酸时，产率较低，而加入5当量则使反应平衡转向酰胺键形成。
Table 1. CmCDA catalysed N-acylation of 1 and transacylationof 2 from carboxylic acids 3-9.
为了验证在其他活性氨基基团存在下，CmCDA是否对葡萄糖胺仍具有选择性。研究人员将γ-氨基丁酸(20)与CmCDA、葡萄糖胺(1)进行孵育，LCMS检测发现CmCDA能够特异选择催化葡萄糖胺，随时间递增生成21(Scheme 3)。考虑到CmCDA具有水解活性，能够催化去乙酰化，研究人员假设CmCDA能否识别乙酰基葡萄糖胺发生N-转酰基反应。众所周知，酰胺键比较牢固，往往难以断裂，通常N-转酰基反应是以高氟酸酐作为羧酸供体在剧烈反应下实现的。为了验证这一假设，研究人员将有机酸4, 5, 7, 8, 9在相同条件下与CmCDA、乙酰基葡萄糖胺(2)进行孵育，果然能生成相应的N-酰基葡萄糖胺10-11, 13-15，并伴有1的产生(Table 1)。这一结果说明CmCDA的转酰基活性是由去乙酰化和酰基化两步组成。
Scheme 3. LCMS analysis of CmCDA-catalysed N-acylation reaction of 1 and protection free 20shows the formation of 21
为了拓展该酶的用途，研究人员设计了“一锅酶法”合成唾液酸苷衍生物的路线(Scheme 4)。首先葡萄糖胺(1)在CmCDA作用下与羧酸供体7, 8, 12反应生成相应的N-酰基葡萄糖胺，在异构酶作用下转变成N-酰基甘露糖胺，然后酶催化与丙酮酸进行aldol加成生成“非天然”的唾液酸衍生物。最后与5-溴-4-氯-吲哚-β-D-半乳糖-吡喃糖苷(X-Gal,22)进行孵育，生成相应的唾液酸低聚糖苷23-25。这一过程只需五步酶催化就可以实现。
Scheme 4. One-pot five enzyme cascade for thesynthesis of sialosides 23-25fromglucosamine and X-gal (22).
综上，研究人员首次发现了能特异催化葡萄糖胺发生N-酰基化的酶CmCDA，该酶能催化不经活化的有机酸与葡萄糖胺直接反应形成酰胺键，生成相应的酰基葡萄糖胺。利用该机制以葡萄糖胺为起始，“一釜五酶”法合成唾液酸衍生物。该工作丰富了N-酰基化酶工具箱，而生物酶法生产唾液酸苷及其衍生物，绿色环保，反应温和、能耗低，为碳水化合物代谢工程应用奠定了基础。
文章链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201914338
整理：Wang, W
文章题目：
EnzymaticN-acylation Step Enables the Biocatalytic Synthesis of Unnatural Sialosides
