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Angew. Chem. Int. Ed.||用于光控药物代谢的可光转换羧酸酯酶抑制剂的化学蛋白质组学新发现

给大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.的文章,Chemoproteomics-Enabled De Novo Discovery ofPhotoswitchable Carboxylesterase Inhibitors for Optically C{attr}3117{/attr}trolled DrugMetabolismDOI: 10.1002/anie.202011163)。本文的通讯作者Alexander Adibekian, 是斯克里普斯研究所化学系副教授。其研究方向是通过开发特定的化学工具,阐明特征不佳的酶的生理作用,并将其应用于研究生命系统中的酶活性;基于有机合成的细胞生物学和基于质谱的蛋白质组学和代谢组学,开发了研究体内翻译后修饰的化学策略。

光药理学是一种有前途的治疗策略,它利用光来实现对小分子生物活性的快速时空控制。迄今为止最常用的光药理学工具是“笼状”生物活性配体,其中光激活它们的释放。然而,最近,能够在活性和非活性状态之间重复异构化的小分子光开关已经成为光学和可逆地控制受体、水解酶和其他酶甚至细胞骨架的强大工具。最常见的是,可光转换探针是通过“唑化”开发的,用结构相似的偶氮苯基团取代二苯乙烯、苄基苯胺或N-芳基苯并咪唑等部分。虽然唑化在过去十年中被证明非常成功,但这种策略仅限于具有已知作用模式的已建立的小分子。

过去的几十年里光药理学取得了进展,但光转换蛋白调节剂的新发现仍然是一个有价值但尚未探索的领域。将光开关结合到小分子配体的原始设计中,将会迅速扩展光开关探针的生物化学应用范围,并最终促进光控疗法的发展,而不是取代结构模拟物来实现唑化。

本文报道了芳基偶氮吡唑脲和砜作为一类新的可光转换丝氨酸水解酶抑制剂;建立了一个化学蛋白质组学平台,能够在复杂的细胞裂解物中快速发现光学控制的丝氨酸水解酶靶点。对一小批芳基吡唑脲的快速测试鉴定出高效、高选择性、可光转换的人羧酸酯酶抑制剂2(CES1CES2),负责人体内含酯药物代谢的酶,是药物代谢调节的有前途的临床靶点。通过光学控制细胞裂解物中免疫抑制剂药物霉酚酸酯的CES1介导的水解,证明了可光转换CES抑制剂的效用。新发现的可光转换CES1CES2抑制剂是第一个报道的通过调节代谢酶的活性来光学控制药物代谢的光药理学工具,代表了理解CES1/2介导的药物和异生素代谢及其他的有价值的药理学工具。

如图1所示,可光转换芳基偶氮吡唑脲丝氨酸水解酶抑制剂的设计概念受到了以前工作的启发,选择芳基偶氮吡唑作为光可转换部分,因为它具有优异的光化学特性,如定量转换和Z异构体的高热稳定性。

    

 1.设计概念和芳基偶氮吡唑脲抑制剂的合成

接下来,测定了所得芳基偶氮吡唑脲抑制剂的光化学性质,并将其与原始的芳基偶氮吡唑光开关进行了比较。如图2,使用紫外-可见光谱确定最佳的E-Z异构化波长,使用紫外-可见光谱确定最佳的E-Z异构化波长,能够获得和分析E-Z-4的晶体结构,E-Z-脲的构象的显著差异可能导致两种异构体对给定的靶丝氨酸水解酶的结合亲和力之间的足够差异。

2.芳基偶氮吡唑脲抑制剂的光异构化性质

接下来,继续使用基于凝胶的竞争性蛋白质组分析方法,在复杂蛋白质组中鉴定脲4-9E-Z-异构体的潜在丝氨酸水解酶靶标。如图3所示,裂解物以化合物的E-异构体作为竞争剂进行预处理,在365纳米或不在365纳米的光下进行处理,并用丝氨酸水解酶特异性活性探针进行标记。使用30 nM抑制剂的进一步评估表明,E-4E-5完全竞争60 kDa这一带,而紫外线照射的E-异构体没有显示出明显的竞争,没有其他的丝氨酸水解酶带被化合物竞争。在肝癌细胞株HepG2中进行另一个竞争性质谱实验,这次使用的是E-4E-5。再一次,E-4只竞争了CES1CES2,而E-5具体竞争了CES1,而在该质谱实验中检测到的其他36种丝氨酸水解酶都没有明显竞争。

3. 竞争性ABPP揭示独特的光控丝氨酸水解酶

为了排除化合物45也可能靶向其他类别的蛋白质,作者合成了衍生自抑制剂5的含炔烃基的探针14。然后用13种来源于不同组织的细胞系裂解物进行基于凝胶的标记实验。实验结果如图四显示,探针14仅标记了HepG2细胞裂解液中的两条带和Caco-2裂解液中的一条带。将HepG2裂解物中富集的探针14通过MS验证,再次确认这些蛋白质为CES1CES2。这些实验有力的证明了作者设计的探针对CES1CES2有着极好的选择性。并且由于与CES的高特异性和共价结合,探针14也可用于CES酶的荧光成像。

4.基于凝胶的标记实验和CSE的荧光成像

因为CES1是目前研究最详细的异源酯水解酶,因此作者进一步将重点放在CES1上。并利用基于凝胶的竞争实验来评估和量化化合物45E-Z-异构体的不同CES1抑制活性。用不同浓度45处理HepG2细胞裂解物,然后用探针14处理,量化CES1的荧光信号并计算IC50。如图5所示,E-4E-5具有相似的IC50。且4E-异构体和经照射后的E-异构体IC50相差7.4倍,而5相差5.7倍,因此继续使用抑制剂4进行研究。

5.CES的光学调节机制

具有可逆性的光转换CES抑制剂,可以在活性和非活性之间重复循环。这在药代动力学的研究中意义重大。作者假设将共价型抑制剂4中的羰基替换为结构相似但亲电性较差的磺酰基,可能会产生非共价的CES抑制剂。如图616的结构。与4相比16的吸收光谱轻微红移至329 nm。且16可以使用365535 nm的光转换EZ构型。如图6所示,16具有优异的热稳定性,16转换为E-16t1/2105 h,同时表现出了良好的光稳定性,异构化可以ZE构型之间循环8次。

6. 芳基偶氮吡唑砜16的光抑制化性质

利用探针14通过凝胶竞争实验检测16是否仍然与CES1结合。通过实验,作者观察到E-16和光照射的E-16之间IC50相差3倍。为进一步证实16CES1的结合是可逆的,如图7,作者进行了凝胶过滤实验和基于凝胶的ABPP实验,证实了16CES1标记的竞争,并且过滤实验几乎完全恢复了CES1的标记。相反4的过滤实验并未恢复对CES1的标记。这些实验结果有力地表明,16的可逆性结合和4的共价结合能力。并且作者结合已报道的探针17进一步提供了在Hep G2裂解物中,16CES1结合的最佳可视化。

7.芳基唑吡唑砜16与CES1可逆结合

鉴于CES1在许多含酯药物代谢中起着重要作用,采用以上抑制剂对CES1活性进行光介导的控制,将为这些药物在细胞和组织裂解物等复杂蛋白质中的代谢和药代动力学提供有价值的信息。如图8所示,作者采用基于MS的分析方法来测量CES催化的含脂前药MMF18水解为MPA192-吗啉醚-1-醇。使用作者设计的可逆抑制剂E-16治疗后,MMF的半衰期比照射后的E-16增加了2.1倍。重要的是,在基因对照实验中,siRNA介导的 CES1敲除也使半衰期加倍,从而精确地重现了E-4E-16的结果。最后,通过可逆抑制剂16的重复光异构化探索了MMF水解的可逆光学控制的可能性。

8.CES1介导的药物水解的光学控制

总得来说,作者成功地通过弱亲电性磺基取代抑制剂4中的羰基,而获得可逆的CES抑制剂,展示了从共价化合物开始设计可逆丝氨酸水解酶抑制剂的新策略。且作者提供的化学蛋白质组学平台,可以扩展到其他支架和光开关,有望实现对其他蛋白质的光学控制。



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