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近年来，亚胺还原酶（IRED）因其能够催化还原胺化反应直接合成烷基化手性胺而受到广泛关注。然而，已报导的IRED大多底物谱较窄、催化效率低、且热稳定性差，使得工程化改造成为其工业化应用的必经之路。尽管IRED在药物分子Abrocitinib和GSK2879552的工业级制备中已经展现出巨大的潜力，但经过大量的突变和筛选工作也成为了扩展其应用范围的阻碍。因此，开发精巧的突变策略显得尤为重要。
氮杂环手性胺是很多药物和农用化学品的关键结构单元。开发绿色、高效、直接的合成烷基化氮杂环手性胺具有重要的应用价值。近日，高书山/雷晓光/孙周通研究员团队合作，通过蛋白晶体解析、理性设计、定点突变和分子动力学模拟等手段，实现了烷基化氮杂环胺的高效和高立体选择性合成，为IRED的理性设计和烷基化氮杂环哌啶胺的工业级生产奠定了基础。
作者以N-Boc-3-哌啶酮和苄胺为模式底物，对IRED酶库进行筛选，仅获得了催化效率非常低，且R构型选择性很差野生型蛋白IR-G36。基于对野生型蛋白的结构解析，作者首先结合序列保守性分析和辅因子氢键网络重构等策略对野生型蛋白进行定点突变改造，从而显著提高了酶的催化效率和立体选择性。随后，作者结合活性口袋残基的定点饱和突变和三轮迭代组合突变策略大幅提高了酶的催化效率（提高3349倍）。作者还通过理性设计对酶进行了热稳定性改造，结合蛋白内部氢键网络的重构和“consensus”策略，实现了热稳定性的显著提高（Tm值提高16.2 ℃）。
最终突变体M5在不同氮杂环酮与多个胺供体的制备级反应中展现出优异的催化效率和立体选择性，并且在模式底物的百克级制备反应中证明了其可放大性。最后，作者结合突变体和野生型蛋白结构的比较、分子对接以及分子动力学模拟阐明了其高催化效率的结构基础。
综上，本文通过工程化改造IRED，使其催化效率提高了4193倍，稳定性Tm值提高了16.2℃，手性选择性从78% (R) 提高至99% (R)以上，成功实现一系列烷基化氮杂环手性胺的工业级合成。
论文信息
Tuning an Imine Reductase for the Asymmetric Synthesis of Azacycloalkylamines by Concise Structure-Guided Engineering
Dr. Jun Zhang,Dr. Daohong Liao,Dr. Rongchang Chen,Fangfang Zhu,Yaqing Ma,Prof. Lei Gao,Prof. Ge Qu,Prof. Chengsen Cui,Prof. Zhoutong Sun,Prof. Xiaoguang Lei,Prof. Shu-Shan Gao
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202201908
