近日，南方科技大学王杰课题组在J. Am. Chem. Soc.杂志上发表了题为“Design and Evolution of A Phosphorescent Protein via the Proximal Encoding of Lanthanide and the Antenna Chromophore”的论文。
遗传编码的荧光蛋白（FPs）是生物过程可视化和分子检测的重要工具，极大地推动了我们对生命系统结构和功能特性的理解。新型荧光蛋白的开发对成像和检测技术的发展具有重要的推进作用，例如多色、光激活和抗光漂白荧光蛋白的研究促进了多通道成像、检测、超分辨成像和长时间成像的发展。然而，现有荧光蛋白的荧光寿命仍局限于纳秒（ns）级，而具有超长发光寿命的磷光蛋白（微秒-毫秒级发光寿命）仍是该领域尚未探索的前沿。
开发长发光寿命的可遗传编码的磷光蛋白（PPs）将在生物检测、诊断和成像应用中发挥明显优势。这种蛋白的发光信号能在背景荧光和其他荧光信号消失后持续存在，从而创建光学信号的正交检测窗口，实现时间分辨检测（TRD），显著提高信噪比和检测灵敏度。然而，长寿命磷光蛋白的开发面临重大技术挑战。尽管通过定向进化的方式可以有效提高荧光蛋白的稳定性、亮度以及颜色，但其荧光寿命仍局限在纳秒范围，说明通过传统的定向进化实现从荧光蛋白到磷光蛋白的转换效果有限。化学标记的方法虽可引入长寿命探针，但存在标记选择性和背景干扰问题。
在长寿命荧光的生色团或发光分子中，镧系金属具有窄发射带和长发光寿命的特性，但其消光系数低，导致单独的镧系金属离子发光强度较弱。有研究表明，具有强吸收的有机配体可通过分子内能量转移敏化镧系金属，该策略在保持镧系复合物长发光寿命的同时显著增强其发射强度。受此启发，作者提出将镧系金属螯合与敏化两个过程集成于单一蛋白中，设计出磷光蛋白：利用多肽或蛋白的侧链簇（如LBT和LanM）螯合镧系金属，并在金属螯合位点附近引入光敏非天然氨基酸（UAAs），从而构建磷光蛋白（图1A）。此设计中，溶液中游离的镧系金属离子因缺乏敏化剂结合产生极其微弱的磷光，而游离UAAs因荧光寿命短，其荧光信号可通过时间分辨检测的方式过滤掉。因此，长寿命磷光信号仅来自同时引入UAAs并螯合了镧系金属的蛋白，从而实现高信噪比、正交信号、免洗检测等一系列性能。
这项工作中，作者设计了可遗传编码的磷光蛋白，并通过定向进化提升其磷光强度。首先将荧光UAA作为敏化基团引入对镧系金属具有高亲和力（皮摩尔级）的LanM蛋白中，经系统筛选UAA插入位点，获得了镧系金属磷光强度较野生型（WT）LanM提升约十倍的起始突变体。然后通过定向进化使LanM变体的磷光信号进一步增强五倍，再通过化学进化改造敏化基团结构，磷光信号进一步提升十倍。最终获得的遗传编码磷光蛋白具有长激发波长、高亮度、长达500微秒（μs）的发光寿命的特点。成功用于铕离子（Eu3+）传感器、蛋白酶检测系统和免疫荧光成像试剂的开发，表明该磷光蛋白可通过时间分辨检测构建高灵敏、高特异性的基因编码传感器平台。
图1 磷光蛋白的设计及UAA-Ln (III)的能量配对筛选
1. 磷光蛋白长寿命发光系统的建立
作者首先从筛选发光中心和敏化基团入手。镧金属独特的4f轨道，f-f跃迁可产生窄发射带和长荧光寿命，但其低摩尔消光系数导致直接激发效率低。通过“天线效应”，有机配体吸收光能后经系间窜越将能量转移至镧系金属离子（如Eu³⁺），可显著增强金属磷光（图1B）。基于此，作者筛选了5种可基因编码的荧光UAAs（图1C-D），测试其与7种镧系金属离子（Ln³⁺）的能量转移效率（图1E）。结果显示，Acd对Eu³⁺的敏化效果最佳，其磷光强度相对其他组合高10倍以上（图1E），因此选择Acd-Eu³⁺为最适的能量转移对。
为了将非天然氨基酸Acd引入到蛋白质中，作者通过筛选实验室存有的PylRS突变体库，成功获得可特异性识别Acd的氨酰tRNA合成酶Acd-RS。接下来，作者寻找到一种适合开发磷光蛋白的镧系元素结合蛋白——LanM蛋白，它对镧系金属具有非常高的亲和力（皮摩尔级）和选择性。此外，LanM还具有可遗传编码、分子量小（<12 kDa）以及易于工程改造的特点，使其成为开发新型磷光蛋白的理想候选蛋白。考虑到LanM能够结合3-4个镧系元素，因此作者接下来在LanM蛋白中设计了42个Acd的引入位点，基于磷光信号强度挑选出Acd可高效地将能量传递给多个Eu³⁺的突变体。经过磷光信号的测定发现，T65、T90和T114位点插入Acd时磷光信号最强（图2）。
图2 光敏非天然氨基酸在磷光蛋白中编码位点的筛选
2. 磷光蛋白的设计与优化
接下来作者基于磷光信号强度测定的方式，对这三个变体分别进行两轮定向进化（图3A）：第一轮通过易错PCR构建突变库（图3B-C），筛选到信号增强的变体（如F34L使T90-Acd信号提升6倍）；第二轮结合易错PCR、多位点饱和突变和有益突变重组建库，最终获得磷光信号提升10倍的LanMELE-T90Acd等变体（图3D-E）。整个进化过程共筛选了超过105个菌落，测试了超过104个单克隆并测序了103个以上的突变体，最终获得相对起始磷蛋白信号强度显著提高的3个突变体LanMAMT-T65Acd（V29A/L66M/A117T）、LanMELE-T90Acd（A22E/F34L/A98E）、LanMLT-T114Acd（F34L/I115T）（图3E）。
图3 基于LanM的磷光蛋白的定向进化
3. 敏化基团的化学进化
为进一步提高磷光蛋白的信号强度，作者从两个角度出发，针对UAA的敏化基团进行设计和优化。一方面，通过提高敏化剂的发射光谱与镧系金属吸收光谱的重叠程度，提高敏化基团激发态到Eu金属的能量转移效率；另一方面，通过提高敏化基团的三重态寿命提高其能量转移效率。据此，作者设计了氟取代（FAcd）和硫取代（SAcd）的Acd同系物，其中氟原子具有强电负性，可通过诱导效应改变分子内的电子云分布，从而导致光谱红移；而硫原子作为一种重原子，可通过增强敏化基团的自旋轨道耦合作用提高敏化基团在激发态时更容易发生系间窜跃，进而提高三重激发态寿命。经比较Acd、FAcd及SAcd的吸收光谱和发射光谱，FAcd光谱确有红移；SAcd吸收光谱相对Acd强，而发射光谱却变弱，说明其三重激发态占比可能更高（图4A-C）。经过氨酰tRNA合成酶筛选发现Acd-RS同样可以高效识别FAcd和SAcd（图4D-E）。将两个非天然氨基酸引入LanMAMT-T65TAG和LanMELE-T90TAG后，发现FAcd的引入并未提高磷光信号强度，而SAcd因重原子效应增加了激发态分子的系间窜跃效率，其插入LanM后磷光信号较Acd提升显著（图4G）。这一发现揭示了敏化基团的荧光量子产率与能量转移效率之间的反向关系：更高的荧光量子产率对应于更少的三重态分子，可能导致能量转移效率降低和磷光信号减弱。这一见解为未来的磷光蛋白进化和优化策略提供了宝贵的指导（图4A-C）。
总之，作者通过战略性地掺入UAA和优化引入位点，实现了镧系金属的敏化，使LanM蛋白的磷光增强了约十倍。随后的定向进化和敏化基团的化学优化进一步提高了磷光信号强度，最终与野生型LanM相比实现了数百倍的增强（图4H）。
图4 磷光蛋白敏化剂的化学进化
4. 磷光蛋白的光物理性质表征
为明确磷光蛋白突变体的光物理性质，进而分析其应用潜力，作者接下来将与Affibody融合表达的LanM突变体（Af-LanM）纯化出来，测试了其磷光寿命和光谱。在保持稳定结构和高Eu³⁺结合能力的情况下，相同浓度的Af-LanMAMT-SAcd比Af-LanMAMT-Acd在615 nm处的荧光信号强度高约5倍（图5B-C），而Af-LanMAMT-T65Acd/SAcd和Af-LanMELE-T90Acd/SAcd在615 nm处磷光寿命达500 μs（图5D-E），说明Eu³⁺的磷光信号强度因敏化基团能量传递效率而异，但其磷光寿命并未受到敏化基团干扰。经磷光光谱测定，100 μs延迟后UAA的背景荧光完全消除，在100-1000 μs之间形成一个时间分辨的检测窗口，对于接下来基于时间分辨检测设计应用场景提供了重要条件（图5F-G）。
图5 基于LanM的磷光蛋白突变体的光物理性质
5. 生物传感器开发与应用
作者基于其设计和进化的长荧光寿命（500 μs）、强Eu³⁺结合力、高磷光强度的磷光蛋白突变体，开发了一个Eu³⁺检测平台，其检测限低于10 nM，对Eu³⁺的磷光响应超过了其他镧系金属1000倍以上（图6A-C）。
由于LanM的磷光依赖于正确的蛋白折叠和镧系金属的螯合，作者接下来通过向磷光蛋白突变体中插入蛋白酶识别序列（如TEV酶的ENLYFQS），开发了一种蛋白酶活性检测平台（图6D）。结果显示，在P2位置插入蛋白酶识别序列在底物切割后磷光信号变化显著，当将该识别序列替换成Caspase-3（DEVD）和HRV 3C蛋白酶（LEVLFQGP）的识别序列时，这些磷光蛋白底物在特定蛋白酶切割时显示出显著的磷光变化，表现出优异的正交性，表明其作为序列特异性蛋白酶筛选平台的潜力（图6D-F）。
生物系统中的背景自发荧光对活细胞和体内成像构成了重大挑战。长寿命（微秒到毫秒）发光探针为所有基于发光的检测提供了新的正交成像通道。基于LanM的磷光蛋白突变体具有长激发波长（390 nm）、长发光寿命（500 μs）、红光发射（615 nm）、大斯托克斯位移（~200 nm）和遗传编码能力，在生物成像中展现出较好的应用潜力。虽然LanM-SAcd磷光蛋白探针需要对细胞进行Eu³⁺染色，但Eu³⁺在50 μM浓度下的毒性可以忽略不计。此外，其独特的发光机制保持了对靶标蛋白标记的高度选择性，在细胞中遗传标记和金属染色靶标蛋白过程中，溶液中Eu³⁺由于吸收弱而产生极其微弱的背景磷光，而游离UAA由于寿命短而不产生磷光。磷光信号仅在同时含有UAA和螯合Eu³⁺的LanM突变体中观察到，使得能够在无需洗涤的条件下进行选择性标记和成像。据此，作者将Af-LanM-SAcd作为免疫荧光二抗试剂，在HeLa细胞中成功实现PD-L1的双通道成像（图6G-H）。虽然传统的共聚焦显微镜无法在615 nm处进行长寿命的时间分辨的成像，但这一技术在概念上可以通过超长寿命通道实现多色成像，为细胞可视化建立了新的正交成像模式。
图6 基于Af-LanM-SAcd开发的检测和成像技术
结论
作者通过非天然氨基酸的引入和蛋白质工程开发了可遗传编码的磷光蛋白，其长激发波长、亚毫秒级磷光寿命、高信噪比和高选择性的特性不仅能够用于检测镧系元素，而且可用于构建蛋白酶传感器和免洗成像探针。在未来的研究进程中，通过扩展底物范围、优化稳定性和表达系统，磷光蛋白有望在药物发现、时间分辨成像和酶活性监测等领域发挥重要作用。
本文的通讯作者为南方科技大学化学系王杰副教授。南方科技大学化学系博士生王金玉为第一作者，课题组成员刘行峰、李开通、彭甜甜、石桃、许倩倩、黄清俊、高子奇为共同作者，陆为教授及其团队成员周洪齐博士亦为本研究做出了贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点研发计划、北京分子科学国家研究中心、深圳市科创委、深圳市医学科院等项目的支持。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c00199
