热蛋白质组学方法 - 有机定制合成网

分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“A Chemoproteomic Approach for System-Wide and Site-Specific Uncovering of Functional Protein N-Glycosylation”。文章的通讯作者是复旦大学的张莹研究员和陆豪杰教授，他们的研究兴趣都集中在翻译后修饰的质谱分析方法。

热蛋白质组学（TPP）技术将细胞热位移分析（CETSA）与多重定量质谱分析相结合，允许了蛋白质热稳定性的全局变化解析，并助力了很多内源相互作用的发现。然而，标准的TPP流程依赖于通过多个通道、多个温度点的定量结果拟合求算溶解温度变化（ΔTm），容易因采样不足而遗漏低丰度蛋白或低化学计量的修饰；此外，这种逐个定量也使得整个TPP流程在操作上较为复杂。为了克服上述缺点，Zubarev等人在2019年提出了一种称为蛋白质组积分溶解度改变（PISA）的替代方案（ J Proteome Res. 2019; 18(11): 4027-37），该方法跳过了经典TPP流程中的逐个温度点定量，而是将溶解温度范围内的所有温度点合并定量，通过计算拟合对应的曲线下面积（Sm）。这一方法极大地简化了TPP的实验操作，部分地解决了上述问题。

但随着PISA的应用，人们发现ΔSm与ΔTm之间的线性关系不够良好，尤其是在ΔTm值较大的情况下。在本文中，作者提出了一种进一步的改进方案，称为Refined-TPP。该方法在低温和高温两个范围内定量曲线下面积，以面积比Rm = Sm/S0实现归一化校正。作者在公共的TPP数据集上进行了基准测试，证明了与PISA相比，Refined-TPP方法能更真实地反映实际的ΔTm值。

随后，作者将该方法应用于已知的HDAC抑制剂 panobinostat的药物靶标分析。结果显示，与传统TPP方法相比，Refined-TPP方法能鉴定到额外的 1016 种潜在靶标。对于已知靶标HDAC6，ΔRm与ΔTm的鉴定结果高度吻合。值得注意的是，Refined-TPP方法也能鉴定到一些被传统TPP方法遗漏的靶标，例如HDAC1，其具有非典型S形的熔解曲线，从而被TPP鉴定所遗漏，但在Refined-TPP鉴定中可被找回。

进一步地，作者将该方法应用于糖基化修饰的研究。作者提出了一种称为糖依赖性热转移分析（GTSP）的策略，即将细胞裂解物按Refined-TPP流程制样后，分别定量全蛋白质组或其中富集的糖蛋白，对于每种蛋白求算两种组分之间的ΔRm。在这种策略下，预期那些具有功能的糖基化修饰将引起Rm的显著变化。结果显示，糖基化修饰的蛋白整体上具有更高的Rm，尤其是 113 个蛋白质的 208 个位点上的 N-糖基化显著地提高了蛋白的热稳定性，暗示这些糖基化修饰可能具有关键功能。作者成功验证了其中一些糖基化修饰的功能，如EFNB2 N36 和 N139 上的N-糖基化稳定了蛋白结构，且改变了蛋白的细胞定位。又例如，NEU1 N352 上的 N-糖基化稳定了其结构，同时对其维持酶活性具有关键作用。