β -内酰胺类抗生素聚合物杂质控制策略的形成与发展
ground-color: rgb(255, 255, 255); overflow-wrap: break-word !important;">中国新药杂志 2020年第29卷第11期，微信来源：凡默谷对聚合物杂质的分析是当前β-内酰胺类抗生素杂质谱控制的最薄弱环节。控制聚合物杂质源于人们对β-内酰胺类抗生素过敏反应的关注。伴随着β-内酰胺类抗生素过敏反应机制、聚合物结构和聚合机制等研究的深入，人们对β-内酰胺类抗生素聚合物的控制理念也逐渐成熟。采用专属的ＲP-HPLC 方法，利用聚合物谱( polymer profile) 评价生产工艺; 同时，利用指针性聚合物控制聚合物的总量和工艺的稳定性，是控制β-内酰胺类抗生素聚合物的理想方案。利用强制聚合样品，通过二维色谱-MS 联用技术，可以快速建立ＲP-HPLC 聚合物谱分析方法，从技术上解决了聚合物谱控制的难题。但如何确定β-内酰胺类抗生素聚合物的质控限度问题仍需要进一步的思考。β-内酰胺类抗生素; 杂质谱; 聚合物; Sephadex G-10 凝胶色谱法; 高效凝胶色谱法; 高效液相色潽法; 质量控制对药物杂质谱( impurity profile) 的控制是保证药品安全性的重要环节，也是目前国内新药研发的关键制约因素。β-内酰胺类抗生素作为临床中最重要的一类抗菌药物，是当前国内仿制药一致性评价的热点品种。由于自身结构的不稳定，β-内酰胺类抗生素产品中有机杂质( 有关物质) 种类复杂、含量较低且结构不稳定。针对β-内酰胺类抗生素杂质的特点，我们已经对其杂质谱研究中的共性策略与方法进行过讨论［1］，基于计算机预测技术，以杂质结构为基础建立了预测头孢菌素杂质毒性的一般策略与方法［2］，并在国内被广泛应用［3 － 4］。聚合物类杂质作为一类引发β-内酰胺类抗生素过敏反应的重要过敏性杂质，虽然不同时期国内已经有多篇综述，对其特性、分离分析方法、质控策略等进行过讨论［5 － 12］，但仍然是β-内酰胺类抗生素杂质谱控制中的最薄弱环节。伴随科学技术的进步，人们对β-内酰胺类抗生素聚合物的认知不断深入。本文以此为线索，通过阐述不同时期人们对β-内酰胺类抗生素聚合物认知的变迁，探讨其聚合物杂质控制理念的形成过程，并结合分析技术的进展讨论β-内酰胺类抗生素聚合物分析的发展方向，以期从整体上思考对该类杂质的分析控制策略。对β-内酰胺类抗生素聚合物的关注源自人们对青霉素过敏反应的关注。自20 世纪初青霉素被应用于临床之后，就伴随有青霉素过敏反应的发生［13］; 至1957 年约有多达1 000 人死于青霉素治疗，即使在皮试过程中，少量的药物也会导致患者发生过敏反应甚至死亡; 青霉素过敏休克是当时最严重的临床不良反应［14］。但导致青霉素过敏反应的原因当时并不十分清楚。青霉素过敏休克属于速发型过敏反应，即IgE 介导的Ⅰ型过敏反应(按经典的免疫学理论，Ⅰ型过敏反应通常分为2 个阶段: 第1 阶段，机体摄入抗原，产生特异的IgE抗体，抗体与肥大细胞结合分布于机体组织，使机体处于致敏状态。第2 阶段，当机体再次接触该抗原或多价半抗原时，抗原与分布于肥大细胞表面的IgE 抗体结合，导致肥大细胞脱颗粒，释放过敏介质，引发机体发生过敏反应。人们将能直接刺激机体产生抗体又能与抗体结合的物质称为抗原( antigen)，但一般认为青霉素等小分子药物仅是单价半抗原( hapten) ，本身不具有免疫原性，也不能引发过敏反应( 不具有反应原性) 。只有和蛋白等大分子载体结合形成抗原后，药物分子才能刺激机体产生特异抗体，也才具有反应原性引发过敏反应。此外，药物分子形成多价半抗原( 聚合物) 也具有一定的反应原性。因此，揭示什么是诱导机体产生青霉素特异抗体的抗原，什么是诱发青霉素速发型过敏反应的反应原，成为揭示青霉素过敏反应原因的关键。1966 年，青霉素过敏反应研究取得重大突破。Levine 首次提出了半抗原模型用以揭示药物过敏反应的免疫学机制。认为青霉素与蛋白质结合形成的青霉噻唑蛋白( penicilloylated protein) 是导致青霉素过敏反应的过敏原［15］。之后，在青霉素及6-APA 产品中均发现了青霉噻唑蛋白类杂质，并证明其在发酵工艺中形成，是诱导机体产生特异性抗体和引发青霉素过敏反应的过敏原［16］。对青霉素与蛋白质结合机制的研究揭示，蛋白质通过自由氨基与青霉素β-内酰胺环的羰基反应，形成的青霉噻唑蛋白结构是稳定的抗原决定簇( 见图2) ［17 － 19］。
虽然后续的研究发现半抗原在体内也可以与机体蛋白结合形成抗原，或在特定的条件下通过其他机制直接诱导T 细胞发生免疫应答反应产生抗体［20］，证明青霉噻唑蛋白类杂质不是机体产生青霉素抗体的必要条件，但减少青霉素制剂中青霉噻唑蛋白类杂质的量可显著降低临床过敏反应的发生率。
我国曾于1973—1975 年间，用商品青霉素及精制青霉素进行过10 万余例的青霉素临床过敏反应研究，商品青霉素的过敏休克率较1968 年世界卫生组织报道的过敏休克率高( 0． 015% ～ 0． 04%) ，而精制后的青霉素，由于青霉噻唑蛋白含量显著降低，肌注后过敏反应发生率较商品青霉素显著降低( 0． 012%) ［21］，证实了青霉噻唑蛋白类杂质是早期青霉素过敏反应的重要过敏原。见图1) 。
当青霉素过敏反应机制被逐渐阐明后，青霉噻唑蛋白是否是青霉素过敏反应中的唯一过敏原这一问题逐渐引起人们的关注。对青霉素聚合物的研究起始于20 世纪60 年代末，受当时分析技术的限制，利用凝胶结合动物被动皮肤过敏( PCA) 试验，判断样品组分是否可以引发过敏反应是较常见的研究方法。高浓度的青霉素( 青霉素钠、羧苄西林钠、氨苄西林钠和6-APA 等) 水溶液，经放置后，利用Sephadex 凝胶分离kav值较小的组分( 分子量较大的组分) ，它们均可以引发动物PCA 阳性反应。上述结果提示，青霉素类药物可以形成聚合物，青霉素聚合物同样是重要的过敏性杂质［22 － 24］，控制其在药品中的含量是减少临床过敏反应的有效手段。对青霉素聚合物结构的认知主要来自20 世纪70 年代初Bundgaard 对6 位侧链含有氨基的青霉素如氨苄西林、阿莫西林的研究［25 － 28］，其聚合反应机制被认为是药物分子中的自由氨基攻击另一分子β-内酰胺环的羰基［25 － 26］。通过DEAE-葡聚糖凝胶A-25 离子交换树脂，从氨苄西林聚合样品中分离出二聚体、三聚体、四聚体和五聚体，利用动物PCA 试验证明聚合物的最基本单元二聚体就能引发过敏反应［29］，进一步证明了控制青霉素聚合物的重要性。我们曾利用Sephadex G-10 凝胶色谱结合动物PCA试验证明，在喷雾干燥工艺和溶媒结晶工艺生产的氨苄西林中，聚合物成分不同，它们引发动物PCA反应的能力也有差异［30］，提示致敏性杂质与生产工艺相关，但受当时分析手段的限制，这种差异的原因并没有被真正揭示。对6 位侧链不含氨基的青霉素聚合物的研究一直较少。20 世纪90 年代初，我们利用Sephadex G-10 凝胶收集氨苄西林和羧苄西林中的寡聚物组分，再利用FAB-MS 分析其分子量，推测它们的可能结构。发现氨苄西林的寡聚物中含有闭环和开环二聚体、三聚体等。羧苄西林的寡聚物中主要含3 种不同的二聚体( m/z = 774) ，推测其是L 和D 型异构体的同聚和异聚产物。根据当时对青霉素聚合反应机制的认知，认为羧苄西林的聚合反应仅与母核结构有关［31］。推测β-内酰胺环首先开环，形成具有亲核攻击能力的仲氨基结构，再与另一分子药物β-内酰胺环的羰基发生反应。然而，根据目前对青霉素聚合反应机制的认知，发生这种聚合反应的可能性较小，羧苄西林二聚体( m/z = 774) 更可能是一个分子中的羧基攻击另一分子的β-内酰胺环形成的聚合产物。1996 年，依据对青霉素类抗生素聚合反应的认知，我们首次将青霉素聚合反应分为2 类: ① 仅和母核结构有关的聚合反应，侧链中的活性基团不参与反应。② 侧链参与的聚合反应，主要以氨苄西林等为代表，通过侧链上的氨基攻击另一分子β-内酰胺环的羰基形成聚合物［6］。后来在探讨头孢菌素的聚合反应时，又将这2 类聚合反应分别称为N 型聚合反应和L 型聚合反应［32 － 33］。虽然L 型聚合反应在后来的研究中被证明普遍存在［10］，氨苄西林、阿莫西林的经典L 型聚合反应产物( 闭环、开环聚合物) 在各国药典中均被收载，但青霉素类抗生素的N 型聚合反应机制一直未被合理解释。理论上所有青霉素类药物均应能发生N 型聚合反应。Ｒaj 等［34］在研究双氯西林的降解反应中发现，化合物的羧基可以攻击β-内酰胺环形成N-酰基化产物，据此我们推测青霉素的N 型聚合反应可能是分子母核的羧基与另一分子β-内酰胺环的反应［35］。此外，欧洲药典( EP) 和美国药典( USP) 在苯唑西林钠和替卡西林钠各论中还分别收载了6-APA 通过氨基与青霉素分子的羧基反应形成的异聚体结构。在哌拉西林钠各论中收载了氨苄西林通过氨基与哌拉西林的羧基反应形成的二聚体结构，提示分子间羧基与氨基的酰化反应也是一种可能的聚合方式。我们对青霉素类药物的各种可能聚合反应途径进行了汇总( 见图3) 。
认为N 型聚合反应( 以青霉素为例) 包括聚合反应I( 药物的2 位羧基与另一分子药物β-内酰胺环的反应) 和聚合反应Ⅱ( 一分子药物β-内酰胺开环形成的羧基与另一分子药物β-内酰胺环的反应) 2 种反应途径，L 型聚合反应( 以氨苄西林为例) 还包括聚合反应Ⅲ( 药物侧链的氨基与另一分子药物β-内酰胺环的反应) 和聚合反应IV( 药物侧链的氨基与另一分子药物2 位羧基的反应) 2 种反应途径。
因此，对侧链含有自由氨基的青霉素的聚合反应，理论上存在4 种反应途径。我们首先通过计算化学的方法模拟各反应途径，计算各自的反应活化能，推测反应发生的难易程度。再利用LC-MS 方法分析模型化合物( 青霉素和氨苄西林) 强制聚合溶液中的二聚体结构，对理论计算结果进行验证。研究表明，4 种反应途径理论上均可以发生，但反应的活化能不同，即反应难易程度不同。对N 型聚合反应，聚合反应Ⅰ的反应活化能较低为优势反应，提示实际产品中由聚合反应Ⅰ形成的聚合物应占多数。LC-MS 分析青霉素强制聚合样品中的二聚体，发现由聚合反应Ⅰ形成的二聚体是主要聚合产物。对6 位侧链含有氨基的青霉素类药物，理论计算提示聚合反应Ⅲ是最容易发生的聚合过滤的分子排阻原理，反应，在氨苄西林强制聚合样品中，由聚合反应Ⅲ形成的二聚体是主要聚合产物［35］。这也较好地解释了实际产品中经典的氨苄西林、阿莫西林L 型聚合产物( 二聚体、三聚体) 是主要聚合物［36］对头孢菌素聚合物的研究同样基于人们对头孢菌素过敏反应的关注。头孢菌素可以发生过敏反应，甚至过敏性休克反应，但发生率较青霉素低［38］。鉴于头孢菌素均由半合成生产，由发酵来源的蛋白结合物类杂质几乎可以忽略，基于对青霉素过敏反应的认知，人们对头孢菌素过敏性杂质的研究主要集中在对其聚合物的研究。20 世纪80 年代初，采用与青霉素聚合物研究相同的理念，先后从头孢噻吩钠和头孢噻肟钠中分离出可以引发动物PCA 阳性反应的过敏性杂质［39 － 40］。采用凝胶色谱法，利用蛋白标准测定杂质的分子量，认为头孢噻吩聚合物的平均分子量为6 580［39］，头孢噻肟聚合物的平均分子量为7 210［41］。虽然后来证明这种测定方法存在较大的偏差，但当时误导人们认为头孢菌素易形成具有较高聚合度的高分子聚合物杂质。为了解头孢菌素的聚合反应特性，我们曾利用Sephadex G-10 凝胶色谱法分析头孢菌素聚合物组分( Kav = 0 组分) ，通过比较不同头孢菌素和其聚合物组分UV 光谱的差异，探讨头孢菌素结构和其聚合反应关系［32 － 33］，以及固体状态下水分、温度等因素对头孢菌素聚合反应的影响［42］。结果显示，头孢菌素可发生N 型和L 型聚合反应; 7 位侧链不具有自由氨基的头孢菌素只能发生N 型聚合反应，所形成的聚合物中保留有7 位侧链结构，但3 位取代基结构消失; 7 位侧链含有自由氨基的头孢菌素，在酸性条件下主要以N 型聚合反应为主，在碱性条件N型聚合反应和L 型聚合反应可以同时发生，2 类聚 － 37］这一现象。合反应的相对强度与化合物本身的结构有关［32］。头孢菌素的3 位侧链及7 位侧链结构均可影响聚合反应速度［33］，固体条件下，样品的水分是影响聚合的关键因素，水分-温度对其聚合反应具有明显的交互作用［42］。虽然受当时对头孢菌素聚合物认知的影响及分析技术的限制，这些结论现在看来并非完全正确，但据此认为头孢菌素聚合物具有高度的不均一性这一观点，对后来形成β-内酰胺类抗生素致敏性杂质控制理念具有重要的影响。利用现代波谱学技术解析头孢菌素聚合物结构的研究直至20 世纪90 年代初才有报道。对头孢噻肟在偏碱性溶液( pH 8． 5) 中的聚合物进行分离，采用质谱、核磁等波谱学方法，发现二聚物的分子量为910，聚合样品中未发现其他多聚物［43］; 对7 种头孢菌素( 头孢唑肟钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢替安、头孢孟多钠、头孢唑林钠和头孢噻吩钠) 水溶液( 10% ～ 50%) 中的聚合物进行研究，仅分离出头孢噻肟和头孢唑肟二聚物［44］，根据头孢噻肟、头孢唑肟二聚物的结构，认为其是头孢噻肟7 位侧链噻唑环上的自由氮基攻击另一分子β-内酰胺环的反应［43 － 44］。不含有自由氨基的头孢菌素或含有氨基但其空间或电荷位阻较大时不宜发生聚合反应［44］。上述结果不仅说明利用凝胶色谱法测定头孢菌素聚合物的分子量存在较大的偏差，也提示头孢菌素可能不易形成聚合度较高的聚合物杂质。头孢菌素与青霉素结构的主要差别在于其含有3 位侧链，因此理论上青霉素具有的4 种聚合反应途径在头孢菌素聚合反应中均可发生。但头孢菌素的3 位侧链及6 元环结构更不稳定，已有研究表明，在头孢菌素-蛋白结合物中，头孢菌素的结构可发生多种改变( 见图4) ［45］，这些改变理论上在头孢菌素聚合物中同样可能发生。此外，欧洲药典还给出了头孢噻肟和头孢西丁脱去3 位侧链形成的二聚物结构( 见图5) ，提示头孢菌素的3 位侧链也是一个聚合反应活性位点。
上述结果提示对头孢菌素聚合物结构的分析较青霉素更加困难。LC-MS 技术的应用与普及使得头孢菌素聚合物具有高度不确定性的神秘面纱被逐渐揭开。虽然头孢菌素具有多个聚合反应位点和多种不同的聚合反应途径，但对一个具体品种，通常只能发现一种主要聚合产物，如在头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑肟和头孢泊肟酯等品种中主要是聚合反应Ⅲ( 一分子药物侧链的氨基与另一分子药物β-内酰胺环的反应) 的产物［46 － 47］。在头孢噻肟钠中主要是氨噻肟结构中的氨基与3 位侧链的聚合产物，而不是聚合反应Ⅲ的产物［46］。
其他含有氨噻肟结构的头孢菌素如头孢曲松钠、头孢他啶、头孢甲肟和头孢吡肟等均存在与头孢噻肟钠类似的现象( 未发表资料) 。而在头孢唑林钠、头孢替唑钠中仅发现有聚合反应Ⅰ( 一分子母核的羧基与另一分子β-内酰胺环的反应) 的产物，且含量较低( 未发表资料) 。不同品种中聚合物的种类和含量与其分子结构和生产工艺有关，如头孢噻肟钠、头孢他啶、头孢甲肟等产品，一般仅能检出少量的主要二聚体; 部分品种甚至可能检测不到聚合物，如头孢地尼等，但产品中聚合降解物的种类可反映其工艺及工艺控制水平( 未发表资料) 。20 世纪80 年代初，碳青霉烯类抗生素开始应用于临床。虽然后来证明碳青霉烯类抗生素在临床中的过敏反应低于青霉素和头孢菌素［48］，但基于对β-内酰胺类抗生素过敏反应的传统认知，加之科学技术的进步对药品注册要求的提高，使得人们对碳青霉烯类抗生素聚合物的认知更为全面。亚胺培南在弱酸性溶液中的聚合反应发生在母核的羧基与β-内酰胺环之间［49］。美罗培南在溶液中的聚合反应为侧链中的仲氨基与β-内酰胺环的反应，β-内酰胺环开环后可形成一对非对映异构体( 二聚体A，B) ; 二聚体A 在酸性和碱性溶液中均能产生，而二聚体B 主要在中性溶液中产生［50］; 但即使是在固体高湿条件( 相对湿度75%) 下，在美罗培南样品中也仅能检测到三聚体［51］; 从厄他培南中，已经分离鉴定出了按不同聚合反应途径形成的多种聚合物( 见图6) ，其不仅丰富了碳青霉素类抗生素的聚合反应途径，也是对青霉素、头孢菌素聚合反应途径的重要验证。
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明确药品的质量控制目的和对象是形成药品质控策略和开发药品质控方法的关键。对β-内酰胺类抗生素聚合物的控制是为了减少临床中的过敏反应。鉴于对β-内酰胺类抗生素过敏反应的认知，药物中的高分子杂质是引发过敏反应的过敏原［5］，因此β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质被认为是关键质控对象。β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质包括青霉噻唑蛋白和聚合物2 类， 1996 年我们首次对其进行定义: 是对药品中分子量大于药物本身的杂质总称，分子量一般在1 000 ～ 5 000 Da，个别可至10 000 Da 左右。按其来源可分为外源性杂质和内源性杂质: 外源性杂质主要来自于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。内源性杂质系对抗生素寡聚物和多聚物的总称，并认为随着药品生产工艺的不断改进和提高，产品中外源性杂质日趋减少，因此对内源性聚合物杂质的控制是重点［6］。这一质量控制理念后来被普遍接受［7 － 12］，并一直主导着国内β-内酰胺类抗生素聚合物分析技术的发展。后来，随着药物分析技术的发展，β-内酰胺类抗生素的异聚体和聚合降解产物被逐渐发现，目前普遍认为β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质可分为3 类:外源性杂质、内源性杂质和其他来源的杂质( 指非药物分子的自身聚合产生，而是合成或使用过程中产生的高分子副产物或者高分子杂质降解产物) ［11 － 12］。根据当时对β-内酰胺类抗生素高分子杂质的认知: ① 青霉噻唑多肽( 蛋白) 类杂质: 发酵中产生的任何蛋白或蛋白碎片都可能带入到产品中; 相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子。② 聚合物类杂质: 青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合物，还能同时发生不同机制的聚合反应。③ 形成的聚合物可发生不同程度的降解。④ 对以异构体形式存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。⑤ 产品中高分子杂质的种类及数量和生产工艺密切相关。我们提出了2 种质控策略: ① 控制高分子杂质的总量，无需分别控制不同结构的高分子杂质的含量，因为它们均是过敏性杂质。② 控制样品中特定“信号杂质”的含量，当认识到某个特定杂质和高分子杂质具有明确的相关性时，则可将该杂质作为“信号杂质”，通过控制“信号杂质”的量，控制药品中高分子杂质的总量。结合当时的分析技术水平，认为采用凝胶色谱法控制高分子杂质的总量是方便可行的方法［6］。该理念后来一直被《中华人民共和国药典》和国内新药注册所接受［8］，并一直主导着对β-内酰胺类抗生素中高分子杂质分析方法的研发方向［7 － 12］。鉴于USPXXIII 中( 1990 年) 收载头孢他啶高分子杂质检测项时称之为“high molecular weight ceftazidime polymer( 头孢他啶高聚物) ”，《中华人民共和国药典》2000年版收载Sephadex G-10 凝胶色谱法控制β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质时，将该检测项被称之为“聚合物”。进入21 世纪，伴随着药品杂质谱( impurity profile)控制理念的逐渐成熟，加之药物分析技术的进步，依据杂质的生理活性逐一制定每一个杂质限度的理念被逐渐接受。与此同时，采用凝胶色谱法控制高分子杂质总量的策略不断受到挑战，特别是凝胶色谱法专属性问题［52 － 54］，使得利用指针性杂质控制高分子杂质的理念再次受到关注［10］。近年采用反相高效液相色谱方法( ＲP-HPLC) 分析常用β-内酰胺类抗生素聚合物的研究越来越多，这不仅解决了凝胶色谱法专属性差等问题［46 － 47， 52， 55］，也显示出通过精准控制指针性杂质，可以将β-内酰胺类抗生素有关物质分析与聚合物分析相统一［36 － 37， 52， 55］，而产品中的聚合物谱( 种类与含量，包括聚合降解物的种类) 与具体产品的工艺及工艺控制水平相关，也为按质量源于设计( QbD) 理念评价产品工艺及工艺控制水平提供了工具。由此可见，采用专属的ＲP-HPLC 方法，通过对具体品种聚合物谱( polymerprofile) 的系统研究，利用聚合物谱对生产工艺进行评价; 同时，利用指针性聚合物( 通常是具体品种中最易产生反应的一种二聚体) 控制聚合物的总量和工艺的稳定性，将聚合物控制与工艺控制相关联，是最理想的质控方案，也是目前仿制药一致性评价中β-内酰胺类抗生素聚合物控制的发展方向。
