有机定制合成网

有机定制合成网 021-51009326
专注化合物定制合成服务

J. Am. Chem. Soc. | 胺、氨基酸和蛋白质的荧光标记与分析

今天为大家带来一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章,文章的通讯作者是梨花女子大学的Jean Bouffard教授和庆熙大学的Youngmi Kim教授,她们主要研究有机合成与生物化学。


       基于荧光的胺类活性染料在胺的传感和生物分子的标记方面具有很高的应用价值。虽然这将是非常可取的,但发射光谱和强度的大变化很少伴随着已知的胺类活性染料与其目标分子的结合。在此,作者报道meso-carboxyBODIPY的五氟苯基(PFP)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酯达到了这一目标。


      作者首先合成了以meso-carboxyBODIPY作为荧光团的2-PFP与2-NHS。这两种产物的荧光性质对溶剂极性不敏感,并且荧光的吸收与发射波长距离较远。当在高极性溶剂中进行操作时,简单的酰胺衍生物显示出很高的荧光量子产率,因此作为者认为其酯到酰胺的转化为荧光的引发提供了合适的基础。

 

      首先,作者探究了CH3CN中2-PFP对甲胺的响应,将等分试样的甲胺(MeNH2,0-50μM)添加到2-PFP(10μM)的溶液中,发射峰(546 nm)随所添加胺的浓度成比例地立即增长。经核磁与HPLC-MS证实剧烈的光谱变化是2-PFP与甲胺反应带来的。并且,546 nm处的荧光强度与添加的MeNH2的浓度在0-6μM范围内成线性比例(R2 = 0.9792)。尽管2-PFP对线性的伯烷基胺表现出快速的反应,并且对较大的支链伯或仲烷基胺具有较高的动力学选择性,但是叔烷基胺和芳族胺未引发“turn-on”响应。


      随后作者,进一步发现固态2-PFP适用于检测有机胺蒸气。浸渍有2-PFP / PEGDME的滤纸可在紫外线(365 nm)下通过对发酵或变质过程中产生的挥发性胺(例如氨和二甲胺)的反应”turn-on”来评估食品的新鲜度。


       尽管2-PFP有能力检测有机溶液中的胺及其通过发荧光的酯-酰胺反应而呈固态的蒸气,但发荧光的检测和胺的标记的最重要应用涉及生物分子。NHS酯是用于制备荧光团和生物胺之间的偶联物的最受欢迎的偶联基团之一,尽管其未结合的染料和标记的物质通常具有几乎相同的光谱性质。但是酯到酰胺的转化导致背景信号的降低。在室温下在缓冲水溶液(10 mM PBS,pH 7.4,1%CH3CN)中研究了2-NHS对生物胺的反应性和选择性,发现探针2-NHS在622 nm处显示出明显的红移吸收,而在648 nm处显示出非常弱的发射。根据动态光散射分析和扫描电子显微镜疏水性,2-NHS形成了稳定的悬浮胶体纳米颗粒。而2-NHS的内消旋酰胺衍生物在缓冲溶液中未形成聚集体,并具有很好的荧光量子产率。


       2-NHS与L-赖氨酸和其他L-氨基酸在水性缓冲液中的反应。由于赖氨酸广泛存在于蛋白质表面,其中的ε-氨基在亲核生物缀合中起反应位点的作用,因此赖氨酸首先被用作反应性分析物。作者发现λabs/λem= 517/547 nm,在547 nm处的荧光强度与0-25μM范围内的赖氨酸浓度之间具有良好的线性关系(R2 = 0.9989),从此检测限低至62 nM。HPLC-MS分析进一步证实,在这些水性分析条件下,在30分钟内2-NHS转化为相应的内消旋酰胺的97%转化率。在标准条件下,赖氨酸或精氨酸在5分钟内可见明亮的荧光响应。此外,在延长的孵育时间后,脯氨酸,组氨酸和半胱氨酸的反应较弱。结果表明,赖氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍与2-NHS快速反应,通过酰胺键的形成而结合。并且其聚集胶体悬浮液中的2-NHS在pH 7.4时可抵抗背景水解。


      接着,作者选择具有表面赖氨酸残基的牛血清白蛋白(BSA,MW 66.4×103Da)作为与2-NHS反应的模型蛋白在凝胶电泳上尝试蛋白质的荧光检测。电泳后未经任何进一步处理即在UV(365 nm)激发下拍摄到凝胶上的黄绿色发射,归因于2-NHS与BSA的共价键合。并且没有发现泳道中BSA条带的位置有偏差,表明共价标记对蛋白质迁移速率没有显著影响。该方法的检测限很低,即使在凝胶上每条带10 ng BSA,仍观察到亮黄色的发射带。


      作者进一步研究了其在水溶液中生物分子定量中的应用。在缓冲水溶液(10 mM PBS,pH 7.4,1%CH3CN,25°C)中将2-NHS与BSA,溶菌酶蛋白或人免疫球蛋白G(IgG)抗体一起孵育,光谱在蛋白质之间没有显着变化,均在5分钟内发生了清晰的荧光“turn-on”响应。在绿色发射谱带的荧光强度与蛋白质含量之间的线性关系在0-1 mg / mL范围内获得,从而可以直接定量检测水溶液中的蛋白质。无机盐和表面活性剂不会干扰2-NHS分析。


       然后作者评估了2-NHS荧光标记活细胞中蛋白质的效用。与2-NHS孵育后,使用共聚焦荧光显微镜对A2058人黑素瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞成像。孵育1分钟内,标记剂在细胞内引起“turn-on”荧光反应,表明细胞质内的蛋白与2-NHS快速酰化。随着时间的推移,细胞明显变亮,孵育30分钟后达到稳定的强烈荧光。2-NHS在任一细胞系中均未显示细胞毒性。这些结果表明,2-NHS能够被动渗透到细胞中,并被保留在细胞内。通过2-NHS标记的A2058细胞的荧光流式细胞术分析还可以跟踪经过4个分裂周期的4天中增殖细胞的不同世代。


       最后,通过将2-NHS直接与不同含胺的细胞器导向基团如苯磺酰胺(内质网靶向)、三苯基膦(线粒体靶向)和吗啉(溶酶体靶向)偶联,作者快速制备一组细胞器靶向的BODIPY染料。所得偶联物3-ER、3-MITO和3-LYSO与之前较简单的内消旋酰胺BODIPY 具有相同的吸收和发射特性,0.8左右的量子产率。所得内消旋酰胺在缓冲溶液中都高度抵抗背景水解。所有这三种化合物都被发现是细胞渗透性的,并且都定位在它们的目标细胞器内。


      总之,这里报道的活化酯2-PFP和2-NHS填补了目前可用的大量胺响应性染料或标签的空白:它们与简单的胺和蛋白质的反应在几分钟内就会产生强烈的荧光“变色”信号。对背景水解的高灵敏度和稳定性使其可广泛应用于从食品质量的及时评估到挥发胺的工业/环境监测,以及溶液、凝胶电泳或活细胞中蛋白质的荧光标记。


本文作者:GuZH

文章链接:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.9b13982

文章引用:DOI: 10.1021/jacs.9b13982


有机定制合成网 » J. Am. Chem. Soc. | 胺、氨基酸和蛋白质的荧光标记与分析

咨询化合物定制合成与纳米材料 提供技术支持和售后服务

咨询定制合成 购买化合物产品
在线营销
live chat
no cache
Processed in 0.275147 Second.