在JACS上报道的一篇标题为 “Hydroxyl-Rich Hydrophilic Endocytosis-Promoting Peptide with No Positive Charge” 的文章。该文的通讯作者是加州大学河滨分校化学系的薛敏教授和南加州大学洛杉矶分校药学院的陈凯教授。在本文中，作者报道了一种不含正电荷的多羟基亲水性细胞内吞肽（EPP6），能够将大量的小分子物质运输到不同的细胞中，在体外和体内模型中均表现出显著的胞吞能力。
运输货物分子进入细胞在生物医学研究中是一个至关重要的问题，近些年得到了学术界的广泛关注。基于纳米技术如脂质体和胶束的递送系统被证明可以通过内吞作用将负载的货物送至胞内，另一方面，基于小分子受体或组件的内吞机制也被重点研究，它们中的代表包括叶酸受体、转铁蛋白和细胞穿透肽(CPPs)等。随着人们对CPP研究兴趣的加深，拥有不同序列的细胞穿膜肽被开发出来。尽管它们的序列各不相同，但有一个共同特征就是拥有高度富集的正电荷。人们认为这些正电荷促进了与细胞外基质和细胞膜的初始相互作用，这是内吞作用的先决条件。但这些正电荷不良的生物安全性可能在阻碍细胞穿膜肽的进一步应用。 本文中，作者团队认为，既然一些基于负电荷表面纳米平台的递送系统有着出色的细胞内吞能力，那么正电荷可能在细胞穿膜肽辅助的细胞内吞中不是起决定性作用。于是他们构建了一种以酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸为组件的多羟基环肽库(EPPs)。这种环肽由5个氨基酸构成，以Click反应首尾相接，并在N端提供了一个化学把手与荧光分子结合。(图1)图1. 作者团队构建的多羟基环肽EPP库结构示意图 他们首先在U87细胞系上测试了这几种EPP将罗丹明染料递送进细胞的能力。通过共聚焦显微镜成像以及流式细胞术可以发现，EPP6展现出了最佳的跨膜递送能力，与传统的细胞穿膜肽cTAT相比有着两倍的提升。且这些EPP在一定的浓度范围内均不会影响细胞活性。他们还将EPP6连接在了不同的染料上，发现均能够成功递送进细胞，这也进一步证明了是EPP6而不是荧光分子本身的内吞现象。他们还发现EPP6能够进入多种细胞系，包括癌细胞、非癌细胞和非人类细胞。(图2)图2. EPP6能够促进多种荧光分子被多种类型的细胞摄取 但在上面的细胞内吞实验中，EPP6的递送在一些细胞系中没有取得成效，这促使该团队研究EPP6内吞现象的机制。他们首先降低了内吞环境的温度，发现在低温下内吞现象几乎消失，而且人工半透膜无法使得EPP6发生转运现象，说明EPP6介导的内吞现象是主动转运。通过分别添加网格蛋白抑制剂和一些膜表面转运受体抑制剂，作者团队发现EPP6介导的运输和网格蛋白相关途径无关。因此他们将能够与小泡蛋白和网格蛋白融合的荧光报告基因转染进细胞中，通过成像的手段发现EPP6和其携带的荧光分子与小泡蛋白的报告标记发生了较多重叠，对Caveolin-1(CAV1, 表达小泡蛋白的基因)的敲低也显著影响了EPP6的内吞水平。这证明了EPP6通过小泡蛋白依赖的内吞途径进入细胞。(图3)图3. EPP6通过动力蛋白和小泡蛋白依赖的过程被细胞内吞 不同的是，该团队发现胆固醇、脂阀和硫酸肝素蛋白聚糖等三个传统意义上的小泡蛋白转运受体的抑制都不会对EPP6的内吞造成影响，这说明该穿膜环肽以一种全新的机制引发小泡蛋白相关内吞。他们对EPP6处理后的U87细胞分选出荧光较强的30%群体进行了RNA-seq，意图在高荧光摄取的群体中找到可能是EPP6内吞受体的上调基因。最终他们发现了FIBCD1膜蛋白水平在这个过程中显著变化。FIBCD1是一种II型跨膜蛋白，其已知受体包括一些多羟基的糖类物质，这与EPP6环肽特性一致。敲除FIBCD1使得EPP6的内吞作用完全消失，而转染了FIBCD1基因的HEK293T细胞也有着明显更高的荧光摄取，这些结果均表明FIBCD1是EPP6内吞的关键受体。(图4)
图4. 通过RNA-seq发现FIBCD1是识别EPP6的细胞表面受体 最后，该团队研究了EPP6内吞后的过程。他们主要通过荧光成像来观察EPP6携带的荧光分子与各细胞器之间的共定位。成像结果表明，EPP6内吞后立即进入早起内涵体，并在30min以后被转运至晚期内涵体，保留6h以上。溶酶体中的EPP6在4h后出现，但数量不多，且EPP6出现了一定程度的核定位，这证明了EPP6携带的货物分子一定程度上逃逸到了细胞质中。 (图5)图5. EPP6及其携带的货物被细胞内吞后的主要去向和分布 综上所述， 该团队开发了一种无正电荷的亲水性多羟基环肽EPP6，有着显著的跨膜递送能力。能够将多种荧光分子递送至多种细胞系中。他们还通过机制分析，找到了FIBCD1作为该环肽的主要受体分子，介导环肽和货物的跨膜运输。EPP6引发内吞后，可以观察到货物分子在细胞质、溶酶体和一些内涵体中广泛存在，表明该亲水环肽是一种有潜力的药物分子或其他生物大分子的新型递送平台。DOI: 10.1021/jacs.2c07420Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c07420
