甲醛是一种既可来源于环境也可内源产生的有毒化合物，在正常生理条件下能与DNA、蛋白质等发生反应，因此胞内存在多种途径将甲醛转化为其他物质。其中甲醛脱氢酶（FalDH）利用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，图1）作为电子受体，将甲醛氧化成毒性较低的甲酸，同时得到还原型辅酶（NADH）。当甲醇进入细胞后，通过醇脱氢酶氧化为甲醛并产生NADH是一条重要转化途径。因此，当一分子甲醇分两步氧化为甲酸，需消耗两分子NAD，生成两分子NADH。由于胞内NAD(H)关联大量代谢反应及系列生物过程，不难想象细胞转化甲醇和甲醛将影响NAD(H)稳态，产生难以预料的生物学效应。如果能让这些脱氢酶利用非天然辅酶，就可能将甲醇和甲醛的氧化代谢在辅酶水平与内源代谢隔离，这对合成生物学和化学生物学研究具有重要意义。
图1：甲醛脱氢酶催化的氧化反应（虚、实箭头分别表示基于天然和非天然辅酶的体系） 在该研究中，作者成功改造恶臭假单胞菌来源的FalDH，使其利用一种非天然辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD，图1)。首先，依据FalDH-NAD复合物的晶体结构，选择与腺嘌呤部分距离在8 Å范围内的氨基酸位点，构建FalDH突变体表达文库，通过高通量筛选，发现L236V突变利用NAD活性显著降低。基于序列分析和定点突变，发现A192K及A192R突变几乎不识别NAD。继续以A192K/L236V及A192R/L236V为模板，构建文库和高通量筛选，最终得到多个偏好NCD的FalDH突变体，包括携带A192R/L223V/L236V三位点突变的FalDH*。催化反应动力学分析表明，FalDH*利用NCD比利用NAD的催化效率高150多倍。初步结构模拟分析表明，FalDH*中因R292的侧链朝向辅酶结合口袋内部，有利于体积较小的NCD结合。 该工作获得了有效使用非天然辅酶的FalDH*，对改造其他氧化还原酶也有参考价值。可喜的是，此前赵宗保研究团队已获得使用NCD的甲醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、苹果酸酶、乳酸脱氢酶等，创制了NCD合成酶，并构建出多种NCD-自给的工程菌株。将来可利用这些功能元件和菌株材料，创建基于非天然辅酶的代谢子系统，对胞内物质代谢和能量传递进行精准调控，为生物制造和生物能源产业提供先进技术。 论文信息 Engineering Formaldehyde Dehydrogenase from Pseudomonas putida to Favor Nicotinamide Cytosine Dinucleotide Junting Wang, Dr. Xiaojia Guo, Li Wan, Dr. Yuxue Liu, Haizhao Xue, Prof. Dr. Zongbao K. Zhao ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202100697
