寡核苷酸作为一种易编程的生物分子，可连接功能分子与蛋白质，组装成特定的结构。为了将其应用于体内诊疗，要求作为连接器的寡核苷酸结构必须具备生物稳定性高，无毒，低免疫原性等特征。而使用DNA结构作为连接器主要面临三方面的问题：DNA生物稳定性差造成其体内半衰期短；当仅使用DNA作为连接剂时，为了保持较高的热稳定性要求DNA的尺寸较大；并且DNA有可能引起机体的免疫反应。
为解决以上问题，丹麦奥胡斯大学的Kurt V.Gothelf教授探究了人工核酸中无环（L）-苏氨醇核酸（aTNA）作为连接器的适用性，并将其构建为four way junction （4WJ）纳米结构成功应用于体内。首先，作者探究了aTNA 4WJ的形成。如图1所示，长度为16 nt的四条aTNA序列以等摩尔量在PBS缓冲液中混合30分钟（aTNA-A, aTNA-B,aTNA-C, aTNA-D），通过碱基互补配对形成含有四个8 bp结合臂的aTNA 4WJ。
图1 四种aTNA核苷酸单体的结构以及aTNA 4WJ的形成 作者在每条aTNA链的5’端修饰了NH2，以满足多种不同功能分子的偶联需求。为了进一步对产物进行可视化，作者在氨基修饰的aTNA-C上进行了荧光基团Cy5标记。经过对产物进行凝胶电泳分析，作者发现当四条aTNA链均存在时形成了单一的产物条带（图2a 泳道4），并通过质谱分析进一步证明了4WJ的成功制备。 图2 aTNA 4WJ的产物鉴定及血清稳定性测试 随后，作者研究了aTNA 4WJ的热稳定性，如表1所示，aTNA双链的解链温度为86°C，明显高于DNA双链与DNA-aTNA杂交双链。DNA 4WJ的解链温度低于人体正常生理温度37°C，而aTNA 4WJ的解链温度高达69°C。这说明aTNA 4WJ具有较好的热稳定性，适用于体内环境的应用。进一步地，作者测试了aTNA 4WJ在血清中的稳定性，其在50%胎牛血清中孵育24小时后仍未发生明显降解（图2b），证明4WJ在血清的盐环境中能够保持稳定的结构，并且不能被血清内核酸酶识别，具有良好的血清稳定性。 表1 aTNA 4WJ的热稳定性测试 接下来，作者通过流式细胞术探究了癌细胞KB对aTNA 4WJ的非靶向摄取。结果表明，KB细胞不会摄取aTNA单链、双链以及4WJ结构，这说明aTNA 4WJ作为连接器时不会干扰靶细胞对功能分子的摄取（图3a）。通过将不同浓度的aTNA单链、双链或4WJ结构与人脐静脉内皮细胞HUVEC孵育，作者发现即使高达200 mg/mL的浓度，也未观察到明显的细胞毒性（图3b），这说明aTNA的结构具有良好的生物相容性。进一步，作者利用人外周血单核细胞测试了aTNA 4WJ的免疫应答反应，以PBS为阴性对照，Poly(I:C)为阳性对照，通过定量细胞炎症反应的主要调节因子TNF-a来判断aTNA引起的免疫反应水平。结果表明，aTNA 4WJ并未造成明显的先天免疫反应（图3c）。 图3 aTNA结构的细胞摄取、毒性与免疫原性 基于aTNA 4WJ良好的稳定性以及生物相容性，作者在aTNA-D上修饰了纳米抗体2Rb17c，并与其余三条序列组装成Cy5.5-2Rb17c-4WJ（图4a）。2Rb17c能够与人表皮生长因子受体2（HER2）发生高特异性结合。通过将Cy5.5-2Rb17c-4WJ应用于表达HER2的SKBR3细胞并利用流式细胞术检测细胞荧光水平，作者发现，Cy5.5-2Rb17c-4WJ可以有效结合SKBR3细胞，而且当HER2受体被游离的2Rb17c预先饱和后，Cy5.5-2Rb17c-4WJ与细胞的结合水平明显下降（图4b），说明4WJ与2Rb17c构建的功能分子能够在体外特异性靶向癌细胞。 图4 2Rb17c-Cy5.5-4WJ特异性靶向癌细胞 最后，作者进行了aTNA 4WJ的体内循环研究。由于aTNA 4WJ的直径较小，在体内循环中易被肾小球过滤代谢至体外。为了延长其体内循环半衰期，作者在aTNA-A和aTNA-C上分别修饰了软脂酸（PA），在aTNA-B上修饰Cy5.5荧光基团，并将其组装为三种4WJ（图5a）。PA能够与血清白蛋白（BSA）结合从而延长PA修饰物的半衰期。作者将Cy5.5-4WJ，PA-Cy5.5-4WJ分别与BSA孵育后发现，PA-Cy5.5-4WJ产物条带迁移速度明显下降，说明其与BSA发生了有效结合（图5b）。然后，作者在BALB/cAnNRj模型小鼠中比较了Cy5.5-4WJ、PA-Cy5.5-4WJ以及2×PA-Cy5.5-4WJ的血清半衰期。结果表明，相比于Cy5.5-4WJ，单修饰的PA-Cy5.5-4WJ的血清半衰期少量增加，双修饰的2×PA-Cy5.5-4WJ的血清半衰期显著增加了四倍。24小时后，血清中仍能检测到2×PA-Cy5.5-4WJ的存在。 图5 PA修饰对Cy5.5-4WJ体内半衰期的影响 总的来说，作者开发了一种基于aTNA的纳米结构，具有良好的生物稳定性、生物相容性以及低免疫原性，与纳米抗体组装后能够实现体外癌细胞靶向，并可以通过脂肪酸修饰进一步调控其在药代动力学的血清半衰期，体现了其在医学诊疗领域的应用潜力。 论文信息 Functionalized Acyclic (l)-Threoninol Nucleic Acid Four-Way Junction with High Stability In Vitro and In Vivo Dr. Anders Märcher, Dr. Vipin Kumar, Dr. Veronica L. Andersen, Kassem El-Chami, Dr. Thuy J. D. Nguyen, Mads K. Skaanning, Dr. Imke Rudnik-Jansen, Dr. Jesper S. Nielsen, Prof. Dr. Kenneth A. Howard, Prof. Dr. Jørgen Kjems, Prof. Dr. Kurt V. Gothelf Angewandte Chemie International Edition
