体外和生理膜蛋白复合物的非变性top-down质谱分析

分享一篇发表在Mol Cell Proteomics上的文章：Native Top–Down Analysis of Membrane Protein Complexes Directly From In Vitro and Native Membranes[1]，文章的通讯作者是耶鲁大学的Kallol Gupta。

细胞膜中蛋白质的大分子复合物是所有膜相关信号传导事件的基础。这些复合物的生物发生过程通常还会受到生物膜本身特定理化性质的进一步调控。因此，研究膜蛋白（MPs）最理想的方式是直接从其所在的生理膜环境中进行研究。近年来，非变性质谱（native mass spectrometry，nMS）已成为研究MPs的重要分析工具。然而，nMS分析MPs的一个突出瓶颈在于，常需要事先通过两亲性去垢剂将目标MPs从生物膜中移除。随后，经过去垢剂溶解纯化的目标MPs才能用于nMS分析。这从根本上限制了利用nMS直接从生理膜中研究MPs复合物的能力。在典型的去垢剂包埋MPs的nMS分析中，MPs通过碰撞诱导解离（CID）从去垢剂胶束中被剥离出来。然而，这种各态历经的（ergodic）激发通常不足以解离生物膜，从而无法剥离整合膜蛋白（IMPs）或外周膜蛋白（PMPs）。此外，这种依赖于四级杆后CID剥离膜蛋白的方式，也限制了随后通过四级杆分离和自上而下碎裂（top-down fragmentation）进一步鉴定被剥离蛋白的可能性，使nMS仅限于MS1级别的完整质量分析。作者最近发现，在电喷雾过程中，通过在喷雾溶液中加入少量增电荷试剂（supercharger），可以在气相中特异性地削弱脂质分子层。利用这一现象，作者直接从完整的蛋白脂质体（proteoliposomes）中检测到了MPs-脂质复合物，从而确定了MPs的功能组织形式和脂质结合特异性。在本研究中，作者进一步扩展了这一方法，开发出一种技术平台，能够通过非变性自上而下（native top-down，nTD）质谱分析，直接从细胞生理膜囊泡中检测并鉴定内源性的蛋白复合物。

图1A展示了该nTD分析平台的实验流程：先是通过源内活化从膜囊泡中喷射出MPs，通过四极杆隔离特定的蛋白质复合物，并对所选复合物进行nTD分析。考虑到CID 碎裂的各态历经限制了大型天然蛋白质复合物的有效碎裂，这里用非各态历经的（non-ergodic）电子捕获解离（ECD）碎裂来补充CID，以提供EThcD的混合碎裂。ECD模块安装在四极杆和碰撞池之间，取消了传输多级杆。作者首先用三种IMPs评估了该方法的普适性。VAMP2、semiSWEET和AqpZ是重组的E.coli生理膜复合物，对应的寡聚体分别为单体、二聚体和四聚体，质量范围为12~100 kDa。这里分别选择了VAMP2、semiSWEET和AqpZ的单体、二聚体和四聚体进行nTD分析（图1B~1D），均获得了丰富的碎片离子。为了模拟真实情境下的未知蛋白鉴定，作者首先评估了用于蛋白鉴定数据的可靠性。为此，首先将VAMP2、semiSWEET和AqpZ的序列手动整合进E.coli蛋白数据库，以验证nTD流程能否正确鉴定这些MPs。随后，利用ProsightNative将相应的MS/MS数据对修改后的E.coli数据库进行检索。在所有情况下，目标蛋白均以极低的P值被成功鉴定（VAMP2：8.6e⁻¹²；semiSWEET：2.5e⁻¹¹；AqpZ：1.3e⁻³³）。作者进一步通过人工验证匹配的末端碎片离子来确认结果。三种蛋白均获得了不错的序列覆盖率（VAMP2：43%；semiSWEET：71%；AqpZ：30%），并且所有蛋白的碎片离子均覆盖了胞质区和跨膜区，表明该实验平台成功建立。接下来，作者将其应用于生理膜蛋白的分析。作者通过精确控制氮气空化的压力（750 psi），能够直接从完整E.coli生理膜中制备出平均直径约100 nm的均一膜囊泡（图2A~2B）用于非变性质谱分析。相比于合成的蛋白脂质体（1000：1），生理膜中的脂质与蛋白质比（30：1~50：1）显著减低，这也意味着需要更加温和的增电荷条件。作者发现甘油不仅可以充当MPs的分子稳定剂，同时它也具有温和的超电荷效应，可以提高MPs从生理膜中被剥离的效率。图2C是E.coli完整膜囊泡的非变性质谱图（5%甘油作为增电荷试剂），检测到了非常多的MPs，质量范围为16~500 kDa。

图1. 体外脂质体MPs的nTD-MS分析。（A）nTD-MS分析平台的示意图；三种重组E.coli生理膜复合物的nTD-MS分析：（B）VAMP2、（C）semiSWEET和（D）AqpZ。

图2. nMS分析从生理膜囊泡中的MPs。（A）氮气空化前后的E.coli膜囊泡的电子显微镜图；（B）从完整E.coli生理膜中制备出的膜囊泡的直径；（C）膜囊泡的nMS分析。

随后，作者直接在生理膜上进行nTD质谱分析，以鉴定MS1中检测到的MPs复合物。质量为102.7 kDa的MP在图2C中的MS1信号很强。首先对其25+价态进行了基于EChcD的nTD分析，ProsightNative检索将该蛋白鉴定为二氢硫辛酸脱氢酶（DLDH，一种外周膜蛋白），如图3所示。有趣的是，其测得的母离子质量（102.7 kDa）略高于 DLDH 单体质量的两倍，提示该蛋白可能以寡聚体形式存在，并带有内源性配体。为此，作者进一步进行complex-up分析确定了其寡聚体为二聚体，可以清晰检测到与单体质量相吻合的单体解离出来（图3C）。此外，还额外观察到了解离出质量为785 Da的单体，对应于内源性配体的结合。通过ProsightNative在小分子数据库中检索该质量，以及通过Uniprot与已知小分子相互作用物进行筛选，可以鉴定该配体为黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），它被报导是DLDH的内源性辅因子，具有氧化催化剂的作用。通过结合nTD和complex-up分析，不仅可以鉴定PMP，还可以揭示其生理状态下的寡聚状态，以及结合的内源性配体。这是迄今为止首次不经任何去垢剂或其他膜模拟物，直接从完整生理膜中对内源性寡聚蛋白复合物进行nTD鉴定的实例。这也为利用nMS直接研究MPs-药物结合开辟了一条有前景的技术路线。采用该策略，作者也成功鉴定到了图2C中的其他多种MPs（参见支撑材料）。

图3. 113, 113);">E.coli膜囊泡中内源性蛋白质的nTD和complex-up分析。（A~B）基于EChcD，对102.7 kDa的MP（25+）的nTD分析，及其序列覆盖率谱图；（C）102.7 kDa的MP的complex-up分析。

作者还考察了一种BAM复合物，其由BAM-A（IMP）及四个外周膜蛋白BAM-B/C/D/E组成的异源五聚体。在机体对抗革兰阴性菌的过程中，BAM复合物（其他外膜蛋白的伴侣）已成为关键靶点。BAM 对于外膜的稳定性至关重要，废除其功能会使机体易受细菌感染。目前没有上市的抗生素针对BAM复合物，使其成为针对抗生素耐药革兰氏阴性菌的非常有希望的靶点。根据其异源五聚体的理论分子量，作者关注质量范围为190~220 kDa的MPs。这里先是对候选MPs进行complex-up分析，以快速锁定解离出与BAM亚基质量相匹配的MPs，然后再进行nTD分析。图4A是BAM复合物的complex-up分析结果。经CID激活后，该复合物产生与各亚基质量完全吻合的亚复合物，也说明了该异源五聚体的解离过程是非对称的。结合对亚复合物的complex-up分析，图4B对BAM的去卷积谱图也发现了多种脂质化的proteoforms，增加的质量对应棕榈酸及油酸酰基链，它们是E.coli膜中最丰富的两种脂肪酸链。将E.coli膜囊泡与100 μm MRL494（一种具有抗菌活性的合成小分子）在冰上短暂孵育后，在nMS谱图中观察到了BAM复合物出现了新的卫星峰，与对照实现相比，其质量对应于BAM复合物与MRL494的结合（图4C），在complex-up实验也观察到了MRL494和无配体结合的BAM复合物的解离（图4D）。该结果也首次为MRL494与BAM复合物在生理环境中的直接相互作用提供了直接证据。

图4. BAM复合物及其配体的nMS分析。（A）BAM复合物的complex-up分析；（B）BAM复合物的去卷积谱图；（C）BAM复合物与MRL494孵育的nTD分析；（D）BAM复合物与MRL494结合的complex-up分析；（E）BAM-E的序列覆盖率谱图。

总的来说，本工作建立了一种技术平台，能通过nTD-MS直接从细胞生理膜囊泡中检测并鉴定内源性的蛋白复合物：先是源内激活从膜囊泡中喷射出MPs，通过四极杆隔离特定的蛋白质复合物，对所选复合物进行nTD和complex-up分析，准确鉴定蛋白质及测定基于复合物的化学计量比。更重要的是，该方法可以用于研究生理膜上的MPs与药物的结合/筛选。

当然，该分析平台还有一些待提升的空间。MS1分辨率偏低且对超大复合物（约466 kDa）的解析暂无能为力，后续可借助基于Orbitrap的单离子质谱和多级串联质谱策略去解决。由于缺乏前端的色谱分离，整个与MPs相关的蛋白质组都会进入质谱，造成一定程度的离子抑制，这也需要在上游进行干预来精确富集感兴趣的生理膜囊泡，以更好地将nTD用于MPs及其复合物的检测分析。

文章引用：Native Top-Down Analysis of Membrane Protein Complexes Directly From In Vitro and Native Membranes.