定量全局和氧化还原蛋白质组学分析

分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，文章标题是“Benchmark for Quantitative Global and Redox Proteomics Analysis by Combining Protein-Aggregation Capture and Data Independent Acquisition”，通讯作者是来自马德里国家心血管研究中心的Jesús Vázquez教授和Ana Martinez-Val博士。Jesús Vázquez教授主要的研究方向是蛋白质组学分析方法的开发。

蛋白质中的Cys残基能够通过ROS或酶促反应产生多种氧化修饰，包括二硫键，S-亚硝基化和S-磺酰化等，这些Cys上的氧化修饰通过调控蛋白质的结构和功能，在细胞信号转导、功能调控以及心血管和神经疾病等病理过程中扮演着重要的角色。因此，全面、精确地分析蛋白质组的巯基氧化还原状态对于理解生命过程和疾病机制至关重要。

传统的氧化还原蛋白质组学（redox proteomics）技术依赖于差异烷基化策略：首先使用碘乙酰胺（IAM）封闭游离巯基（还原态），随后使用还原剂将Cys的氧化修饰还原，再用另一种烷基化试剂（如MMTS）进行标记新产生的巯基（氧化态），实现对不同氧化状态的Cys残基的分析。然而，这类方法通常操作较为繁琐，且由于Cys上同时带有IAM和MMTS修饰，与依赖计算机预测谱图库的数据非依赖性采集（DIA）模式不兼容，限制了该方法在大队列临床样本中的应用。作者希望能够简化制样流程，并能够使该方法与DIA相兼容。

作者开发出了被称为PACREDOX 的集成化工作流程，相比于传统氧化还原蛋白质组学策略，该方法在样品前处理和质谱采集与数据分析两方面均有了创新。在样品前处理方面，作者使用Protein Aggregation Capture (PAC) 替代传统的FASP，在高乙腈相中使用羟基磁珠捕获所有的蛋白，并将Cys标记、氧化Cys还原和酶切全都在磁珠表面完成，显著缩短了样品制备时间，并能够兼容自动化样品制备流程。

为了能够使该方法与DIA兼容，作者首先分析了PACREDOX的DDA数据，结果显示其中约有30%的MMTS修饰，与FASP制样的结果一致；此外作者发现，对于序列相同的肽段， MMTS标记和IAM标记产生的二级谱中的碎片离子基本一致，而区别仅仅是保留时间更长。作者通过对实验数据的拟合，给出了新的保留时间校正方程：，将此方程应用于DIA-NN预测库中MMTS肽段的保留时间，成功将MMTS肽段的鉴定比例从7%提升至预期的30%，与DDA结果一致。