1890年，Emil Fischer确定了葡萄糖的立体结构，并于1902年获得了第二届诺贝尔化学奖。在有机化学领域这是一项十分重要的工作，该工作中Emil Fischer通过实验和逻辑推理的完美结合，在检测手段十分有限的情况下完成了对葡萄糖及相关结构的分析，其过程充满了科学的严谨与艺术般的优雅，在ACS的投票评选中被评为化学史上最美实验第三名。
Hermann Emil Fischer (1852 – 1919)，德国著名化学家，对糖、酶、嘌呤、氨基酸和蛋白质进行了广泛深入的研究并取得了突出的成就，因而荣获1902年的诺贝尔化学奖。
在介绍该分析研究过程之前，我们必须了解1884年Fischer开始他对糖类结构研究时的背景。1848年巴斯德分离并发现了酒石酸的对映异构体（ACS最美实验榜首），1874年{attr}3120{/attr}’t Hoff（首任诺贝尔化学奖获得者）提出碳的四面体构型以解释物质的旋光异构现象。Fischer接受了Van’t Hoff的理论，并开始使用我们现在所熟知的“Fischer投影式”描述有机化合物中碳周边的原子空间排布。
当时人们所知的单糖包括(+)-葡萄糖，(+)-半乳糖，(-)-果糖，以及(+)-阿拉伯糖。其中(+)-为右旋标记，与d-标记含义相同，(-)-与l-为左旋标记。可用的研究手段包括燃烧分析，熔点测定，旋光测定和分析推理。
在十九世纪80年代后期，Heinrich Kiliani发展了通过氢氰酸进行增碳扩链的方法，将醛糖转化为对应的多一个碳的醛糖酸，该方法又被称为Kiliani-Fischer合成（如图1a）。该方法的第一步通过氰基对C1醛基进行亲核进攻，延长碳链并生成新的手性中心。对第一步获得的产物在Pd/BaSO4催化下加氢还原，得到的亚胺水解即能生成一对C2差相异构体，均为增加了一个碳原子的新的醛糖。随后将其氧化为醛糖酸，对获得的醛糖酸用红磷与氢碘酸还原，能将多羟基羧酸还原为对应的烷基链酸(图1b)。采用上述一系列技术对已知单糖进行检测，(+)-阿拉伯糖被转化为正己酸，证明其为醛糖戊糖；(+)-葡萄糖形成正庚酸，为醛糖己糖。另外，Fischer还经(+)-葡萄糖制备了(+)-甘露糖。
a)
b)
图1. 以D-甘油醛为例说明 a)Kiliani-Fischer合成；b)后续采用红磷与氢碘酸还原
通过上述初步实验，在画出葡萄糖等醛糖己糖结构时，除了非手性的C1与C6外，C2~C5这四个碳原子均有两种可能采用的手性，从而有24=16种可能的结构。这16个可能结构列举如下图1所示，其中的红色圆形代表醛基。
图2. 全部16种醛糖己糖可能采用的构型
将C1还原为OH可得相应的糖醇，或将C1与C6均氧化为COOH，即可获得相应的二酸；以上两种操作保证C1与C6氧化态相同，能够增加这16个分子中某些的对称元素。对(+)-葡萄糖与(+)-甘露糖进行上述操作，获得的葡萄糖醇、葡萄糖二酸、甘露糖醇、甘露糖二酸均具有光学活性。在全部16种构型中，采用蓝色圆形代表C1与C6氧化态相同（图2），其中的1,7,9,15四个结构由于对称元素而没有光学活性，与(+)-葡萄糖及(+)-甘露糖的实验事实不符，因此首先被排除。
图3. 通过衍生物对称性首先排除4种结构
在1875年Fischer早年的研究中，他发展了通过还原苯基重氮盐形成苯肼的反应，为随后他利用苯肼与糖类反应进行结构鉴定奠定了基础。随后的工作中Fischer发现醛糖的C1与C2能够与两分子苯肼发生反应生成脎（如图4）。
图4. 以(+)-葡萄糖为例说明糖脎的形成
图5. 对图1中16的基本结构进行光学活性相关的初步排除
接下来的分析需要用到Kiliani扩链方法。Fischer选取的扩链反应底物为甜菜中提取的醛糖戊糖(+)-阿拉伯糖，扩链产物为葡萄糖酸与甘露糖酸。实验证明这两种酸均为先前得到葡萄糖酸与甘露糖酸的对映异构体，并能够进一步还原制备(-)-葡萄糖与(-)-甘露糖。结合之前(+)-葡萄糖与(+)-甘露糖形成相同糖脎的结果，已经能够较有力的说明二者的C3，C4，C5构型相同，且与(+)-阿拉伯糖恰相反。因此随后需要做的就是确定(+)-阿拉伯糖的构型，剩下C2处的两种构型就能够分别对应(+)-葡萄糖与(+)-甘露糖。
图6中所示的为剩余的8种(+)-葡萄糖与(+)-甘露糖的可能构型，以及与之对应的4种“阿拉伯糖”（A, A’, B, B’）。图中阿拉伯糖C2处红色为新引入的羟基，每个阿拉伯糖能通过Kiliani扩链等反应制备其下（上）方对应的两个醛糖戊糖，且A与A’，B与B’分别为两对对映异构体。
通过对新获得(+)-阿拉伯糖C1与C5的氧化，Fischer获得了具有光学活性的三羟基戊二酸（阿拉伯糖二酸），由于B和B’氧化后的二酸具有对称性，该结果表明(+)-阿拉伯糖结构很有可能是A或A’。但对其还原，则获得似乎并不具有光学活性的阿拉伯醇，结果又指向了B或 B’。这样矛盾的实验结果得到了Fischer的重视。考虑到多元醇形成硼酸酯络合物后能够增强旋光，Fischer将之应用于上述方法制备得到的阿拉伯醇，最终观察到了显著的旋光，再次确定了A与A’结构的正确性。通过该实验结果，Fischer最终确定了(+)-阿拉伯糖为A或A’中的一个，也即(+)-葡萄糖为3,4,11,12中的一个。
在接下来的分析中，幸运的是，1886年一种新的醛糖戊糖，(+)-木糖被发现。采用与上述对(+)-阿拉伯糖相同的操作，Fischer发现其最终获得产物没有光学活性。从而认为木糖结构为B或B’。对(+)-木糖经过Kiliani扩链反应后生成的醛糖虽然并非(-)-葡萄糖，但其用HNO3氧化所得到二酸是(+)-葡萄糖二酸的对映体。因此Fischer将该结构认为是(+)-葡萄糖将C1与C6交换后得到的结构。与先前推测的结果两相对照，可知葡萄糖的结构为3或11中的一种。根据推测得到的(+)-木糖与(+)-葡萄糖的结构获得新醛糖与随后氧化的反应历程如图7所示。
图7. 推测得到由(+)-木糖至新四羟基己二酸历程
图8. D-甘油醛结构
在Fischer进行实验和推理的整个过程中，其实也存在着一些漏洞。例如，在利用多羟基二酸相关的实验进行推理时，Fischer默认只有属于相同立体化学家族的两个化合物才能被转化为相同的二酸。在了解糖类家族的复杂后我们很容易知道，实际上这一想法是不严谨的。也就是说，不能通过立体化学关系（无论化合物是否为光学活性）来判断化合物本身的相关性。另外，对糖类光学活性的描述存在混乱，也导致了之后一段时间内科学家们进行糖类研究时的混乱。Fischer将(+)-葡萄糖定为d-后，其余糖类能与之相互转化的均为d-。而显然随着糖化学的发展和化学手段的丰富，这样的衍生路径不是唯一的。
Fischer的工作在有机化学领域具有重要的意义，不仅因为葡萄糖结构的确定对糖化学的发展奠定了坚实的基础，另外，也通过其研究向人们展示了化学研究中精密的分析、丰富的反应、灵活的手段，大胆假设小心求证，是科学家们探索未知的可贵品格。
作者：ZY 校稿：H. Lu，ZZC
参考文献：
1. http://ursula.chem.yale.edu/~chem220/STUDYAIDS/history/Fischer/fischer.html
2. https://www.masterorganicchemistry.com/2018/10/29/the-ruff-degradation-and-kiliani-fischer-synthesis/
3. E. Fischer, Eur. J. Org. Chem. 1892, 270, 64.
4. M. A. Rosanoff, J. Am. Chem. Soc. 1906, 28, 114.
