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导读
近日，武田制药的Shuhei Ikeda研究员报道了一类新型螺环结构的高活性的可逆MAGL抑制剂，可作为潜在的抗癌药物。相关成果发表在J. Med. Chem.上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00432）。
单酰甘油酯脂肪酶（Monoacylglycerol lipase, MAGL）是丝氨酸水解酶超家族的一员，能够将2-花生四烯酸甘油酯（2-AG）水解成花生四烯酸（AA）和甘油，从而调节体内大麻素系统信号转导。2-AG和N-花生四烯酸乙醇胺均是内源性大麻素，可通过大麻素受体（CB1和CB2）参与调节生理过程，如痛觉、味觉、学习、记忆及奖励行为等。研究发现，抑制单酰甘油酯脂肪酶会导致脑中2-AG水平升高伴随着AA水平的下降，使得内源性大麻素系统信号转导增强而表现出抗神经炎症效果（Figure 1A）。研究学者还发现抑制MAGL能够显著降低神经病理病变，减少神经炎症和退化的发生，因此被认为是治疗神经系统疾病（如帕金森、阿尔兹海默症、多发性硬化、癫痫和抑郁）的新靶点。此外，MAGL的过表达存在于恶性黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌等多种癌症中，与癌细胞的增殖、存活、血管生成和侵袭等密切相关。因此，研发靶向MAGL的小分子抑制剂具有重大意义，不仅可作为治疗神经系统疾病和癌症的潜在药物，还能够作为一种小分子探针来研究丝氨酸水解酶的功能。尽管已经开发了不少MAGL抑制剂，但仍缺乏高活性、副作用小和高选择性的抑制剂（Figure 1B）。因此，研发靶向MAGL的选择性可逆抑制剂是目前的新方向。下载化学加APP，阅读更有效率。
近日，武田制药的Shuhei Ikeda研究员报道了一类新型螺环结构的高活性的可逆MAGL抑制剂，可作为潜在的抗癌药物。相关成果发表在J. Med. Chem.上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00432）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于可逆抑制剂c、d和e与MAGL的结合模式，作者通过高通量筛选得到活性优异的先导化合物1（Figure 2）。在共结晶结构图中，化合物1能够很好的占据MAGL的活性位点，且展现出全新的结合模式。根据结合模式图，作者发现化合物1的中心酰胺羰基氧原子指向氧负离子穴，并与催化中心Ser122残基附近的Ala51和Met123残基的酰胺形成氢键，表明化合物1的结合模式是非共价可逆的。此外，右侧基团（RHS）的羰基氧和NH分别与Arg57和His121残基形成了两个氢键；左侧基团（LHS）则为亲脂性基团，这与其他化合物与MAGL蛋白的结合方式大不相同。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于上述构效关系，作者认为中心羰基的存在对于MAGL抑制活性至关重要，因此将优化重点置于两侧基团（Figure 3）。由于Arg57和His121残基的氢键相互作用对化合物活性和配体亲脂性效率（LLE）具有很大影响，作者在酰胺与Linker（L1）之间设计了一个环状结构，希望能够在保持活性的同时改善其LLE。此外，为了改善化合物的物化性质，作者尝试筛选不同大小的环、Linker（L2）和苯环取代基。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于上述设计思路，作者尝试通过在苯环插入N原子或去除苯环结构以增强其LLE（Table 1）。首先，将苯环替换成吡啶环得到化合物1a-1c，对MAGL酶的抑制活性均有所下降，而LLE值则略有增加。接着，作者去除苯环得到化合物1d，其活性急剧下降（IC50 = 1100 nM）；缩环得到的化合物1e，相比于化合物1，其活性下降了4倍，但LLE基本不变。基于结构更加刚性的化合物1e，作者插入氧原子得到化合物1f，活性和LLE均有所下降，这可以解释为氧原子的引入改变了化合物构型而影响氢键的形成。最后，作者通过对化合物1e拆分得到化合物1g（R-构型）和1h（S-构型），发现化合物1h具有良好的活性和LLE值及适中的MDR1外排率（1.5）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于化合物1h优异的活性和LLE值，其可作为进一步结构优化的基础。首先，作者利用分子对接研究了化合物1h的结合模式（Figure 4B），发现除RHS基团的羰基氧和NH分别与Arg57和His121残基形成了两个氢键外，其Linker并没有与蛋白形成相互作用。基于此，作者提出设想：将Linker设计成螺环结构以固定其活性构象，从而改善其抑制活性和LLE值（Figure 4A）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
根据此思路，作者初步合成了化合物2a-c，并对其进行了分子对接研究。结果显示，螺氮杂环丁烷化合物2a和(2r, 4s)-螺环丁烷化合物2b能以合适的距离和角度与MAGL蛋白的Arg57和His121残基形成两个氢键（Figure 5A, B），而(2s, 4r)-螺环丁烷化合物2c却丧失了与His121残基的相互作用（Figure 5C）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于化合物1h，作者采用环化设计策略对含双氢键结合受体的RHS基团片段进行了筛选（Table 2）。与分子对接结果一致，化合物2a和2b的蛋白抑制活性显著增强，而化合物2c的活性和LLE值均显著下降（IC50 = 890 nM, LLE =3.3）。在化合物2b的基础上，作者在羰基邻位插入氧原子得到化合物2d，其活性提升了2倍（IC50 = 3.4 nM），推测可能是与His121残基形成更强的相互作用。接着，作者将氮杂环丁烷替换成五元环和六元环分别得到化合物2e和2f，发现其活性相比于2a，前者下降了近7倍，而后者几乎丧失了活性。其中化合物2d的活性最为优异，可以作为进一步结构优化的基础。
（图片来源：J. Med. Chem.）
接下来，作者对化合物2d进行了分子对接研究（Figure 6B）。发现除RHS基团和中心羰基氧与蛋白质形成了关键的氢键作用外，其LHS基团并没有与蛋白形成相互作用。因此，作者将筛选含氮杂环的大小、Linker和苯环取代基作为后续的优化重点（Figure 6A）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
根据化合物2d的分子对接研究，作者认为对LHS基团的修饰能够改善化合物的hERG毒性和渗透能力（Table 3）。首先，作者在哌啶环的4-位引入甲基得到化合物3a，其对MAGL的抑制活性有所提高，但hERG毒性没有明显变化。在亚甲基上引入甲基得到化合物3b，其对LMP7的抑制活性达到了2.7 nM，并且hERG毒性也大大降低。基于化合物3b，作者又尝试在亚甲基上引入乙基和三氟甲基得到化合物3c-d，hERG毒性又进一步降低。将化合物2b中的氧亚甲基替换成亚甲基氧得到化合物3e，其活性和hERG抑制活性均有所下降。此外，作者将氧亚甲基和亚甲基氧与吡咯烷和氮杂环丁烷组合得到化合物3f-i，相比于化合物2d，四个化合物的蛋白抑制活性均急剧下降，但其hERG毒性同样显著降低。其中化合物3i的活性一般，但其hERG毒性低，可以作为进一步结构优化的基础。
（图片来源：J. Med. Chem.）
紧接着，作者基于化合物3i对末端苯环进行研究（Table 4）。保持苯环2-位氯原子不变，将苯环4-位氟原子替换成甲基、氯原子和三氟甲基得到化合物4a-c，其活性随着取代基亲脂性的提高而提高，说明苯环的4-位取代基对于化合物的活性具有至关重要的影响。因此，作者开始评估3,4-二取代对于化合物活性的影响，发现将2-位氯原子移至3-位得到的化合物4d，其活性和LLE值均略有提高。于是，作者将甲基、氯原子和三氟甲基组合得到化合物4e-k，相比于化合物3i，化合物的活性均显著提高，且LLE值达到5.8-6.0。其中仅有化合物4f在蛋白抑制活性、LLE值、MDR外排率和hERG毒性之间达到最优平衡，可以作为进一步结构优化的基础。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于化合物4f的蛋白抑制活性，作者对其进行了初步的体外性质研究（Table 5）。从表中可以看出，化合物4f表现出优异的热力学水溶性，利于临床阶段的体内研究。接着，作者利用表面离子共振实验对化合物4f与MAGL蛋白的结合特性进行了研究，结果显示，化合物4f的Koff和t1/2分别为0.0036 s−1和3.3 min，表明化合物4f是可逆的MAGL抑制剂。最后，化合物4f表现出优异的的选择性，仅对MAGL蛋白有优异的抑制活性，而对FAAH和ABHD6几乎没有抑制作用，表明化合物4f具有成为选择性MAGL抑制剂的潜力。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于化合物4f的蛋白活性和体外性质，作者对其进行了初步的体内性质研究（Table 6）。从表中能看出，无论是血浆还是脑中，化合物4f均表现出剂量依赖性的浓度增加，且伴随着优异的BBB渗透性，这可以解释为化合物4f的溶解性和良好的MDR1外排率。随着脑浓度的提高，2-AG的水平显著提高伴随着AA水平的降低（Figure 7）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
（图片来源：J. Med. Chem.）
化合物4f的合成路线如图所示（Scheme 2&4）。首先，3-氧代环丁烷甲酸叔丁酯12a与羟胺在NaOAc条件下以92%的产率得到肟13a，13a再经尿素过氧化氢和三氟醋酸酐氧化得到硝基化合物14。接着，化合物17与甲醛发生Henry反应得到化合物22a；再经Raney Ni还原和三光气关环得到螺环化合物23a；化合物23a经TFA水解得到关键中间体24。最后，经EDCI和HOBt处理发生酰胺缩合得到化合物4f，其余片段也可通过类似方法合成得到。
（图片来源：J. Med. Chem.）
（图片来源：J. Med. Chem.）
小结：武田制药的Shuhei Ikeda研究员基于结构的药物设计发现了一类新型螺环结构的高活性的可逆MAGL抑制剂，展现出一定的临床潜力，未来或许有望进入市场，为治疗神经性疾病和多种癌症提供了新的治疗手段。
