新型甲基转移酶Asc-Orf2催化安丝菌素酰胺甲基化并增强抗癌活性

分享一篇发表在JACS上的文章，题目为"A Carbamoyl N-Methyltransferase Catalyzes N-Methylation of the Primary Amide in Ansacarbamitocin Biosynthesis"。通讯作者是山东大学的沈月毛教授，课题组专注于天然产物生物合成与酶工程研究。

在微生物次级代谢中，针对一级酰胺的N-甲基转移酶极其稀有，而酰胺甲基化对天然产物的稳定性和生物活性至关重要。安丝菌素类化合物（如美登素）是知名抗癌剂和抗体药物偶联物（ADC）前体，其3-O-酰基侧链是抗微管活性的关键决定因素。安丝氨基甲酸酯（ansacarbamitocins）独特之处在于其3-O-(N-甲基)-氨基甲酰基修饰，但负责该修饰的酶长期未知。传统化学甲基化面临伯酰胺平面性高、反应活性低的挑战，而现有酶（如Asm10）仅催化内酰胺甲基化，无法作用于伯酰胺。

为鉴定这一关键甲基转移酶，作者重构了Amycolatopsis alba DSM 44262的asc基因簇（GenBank PQ786037），发现一个分叉酶Asc-Orf2。系统发育分析表明，Asc-Orf2与PF05175家族的AerE（催化D-天冬酰胺甲基化）同源，但不同于已知的氨基甲酰甲基转移酶PsmA。

通过构建Δasc-orf2突变株，作者发现其无法产生甲基化代谢物1和2，转而积累未甲基化中间体3和4。体外酶活实验揭示，Asc-Orf2可高效催化化合物5（无4,5-环氧化物修饰）甲基化为6，但对含环氧化物的9活性微弱，表明甲基化发生于3-O-氨基甲酰化后且早于内酰胺糖基化。动力学参数显示，Asc-Orf2对底物5的Km为10±1 μM，kcat为2.5±0.1 min⁻¹。该酶严格的位点选择性使其无法甲基化格尔德霉素等其他含氨基甲酰天然产物。

X射线晶体结构显示，Asc-Orf2采用典型的Rossmann折叠，其SAH结合位点由48CCGPA52环构成。分子对接表明，底物5的氨基甲酰基氮原子距离SAM甲基碳仅2.5 Å，适于SN2亲核攻击。序列比对结果表明，不同于保守的NPPF(Y)序列，Asc-Orf2具有独特的116NPPH119催化基序。H119突变导致活性完全丧失，证明其作为催化碱基的功能；N116则通过氢键稳定H119的去质子化状态，协同克服伯酰胺的化学惰性。

利用Asc-Orf2的底物兼容性，作者在工程菌株HGF052中引入asc21b和asc-orf2，成功合成新型3-O-(N-甲基)-氨基甲酰衍生物10和11。其中，化合物8（3-O-(N-甲基)-氨基甲酰DDM）的抗癌活性最为突出：对LNCaP前列腺癌细胞的IC₅₀达0.37 nM，较未甲基化前体7提升1-2个数量级。分子对接证实，甲基化增强侧链疏水性，维持了与β-微管蛋白美登素位点的强结合。

为拓展应用，作者利用S-腺苷(S)-2-氨基-4-(烯丙硫基)丁酸（SAAll）替代SAM，将7转化为3-O-(N-烯丙基)-氨基甲酰衍生物13。通过结构指导的V141G突变，烯丙基转移效率提升20倍，为ADC linker的点击化学偶联提供了直接手柄。