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CDE | 恩替卡韦有机杂质的分析与控制

作者|李晓锋(CDE

内容来源|中国新药杂志 2019.11

整理排版|药研


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恩替卡韦及其口服固体制剂是仿制药申报和一致性评价的热门品种。本文以环戊二烯为起始原料的合成路线为例,分析了恩替卡韦原料药潜在的有机杂质,包括立体异构体、基因毒性杂质、起始原料、中间体、工艺副产物和降解产物等。杂质谱的分析,切勿生搬硬套,应基于对产品特性、生产工艺和过程控制的全面了解。应针对具体情况对有机杂质进行科学合理的控制,以建立完善的有关物质方法。



 
恩替卡韦( entecavir ) ,化学名为2-氨基-9-[( 1S,3 R,4S) -4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲基环戊基]-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮一水合物。其结构式见图1。恩替卡韦是治疗乙型肝炎病毒( HBV) 的口服抗病毒核苷类药物,可选择性地抑制HBV,治疗成人伴有病毒复制活跃和血清转氨酶持续增高或肝组织为活动性病变的慢性乙型肝炎[1 - 2]。恩替卡韦由美国百时美施贵宝公司( Bristol-Myers Squibb) 研制开发,2005 年3 月29 日经FDA 批准在美国上市,2005年11 月15 日恩替卡韦片在中国上市。


图:网络


 
18 届国际抗病毒研究会议( International Conference on Antiviral Research) 指出,作为第3 个用于治疗乙型肝炎的核苷类药物,恩替卡韦要优于拉米夫定( lamivudine) 。一直以来,恩替卡韦是仿制药申报和一致性评价的热点。
 
恩替卡韦合成路线长、工艺难度大、立体结构复杂,具有3 个手性中心,仅光学异构体就有8个,杂质谱是原料药研究的难点。本文从恩替卡韦的性质特点、生产工艺入手,结合文献和研究指导原则,举例来讨论其杂质谱,并提出初步的杂质控制策略。
 
近些年,在仿制药的申报和一致性评价工作中,基因毒性杂质( genotoxic impurity) 的研究与控制不够全面的情况较为常见,充分的基因毒性杂质研究同样为产品能否上市和通过一致性评价的关键。本文针对恩替卡韦工艺特点,提出基因毒性杂质评估和控制的建议。
 


1 恩替卡韦的合成路线


恩替卡韦合成路线国内外报道很多[3 - 6]。起始原料、合成路线或制备工艺不同,对应的工艺杂质体系也会有区别。本文以较为流行的路线1( 图2)为例[5 - 6],来讨论恩替卡韦的杂质谱。



 
以环戊二烯( A)为原料,依次与金属钠、氯甲基苄甲醚以及二蒎烯硼烷配合物( Ipc2BH) 反应制得手性中间体B; 再由不对称环氧化反应制得环氧中间体C; 对羟基以苄基保护,制得中间体D; 中间体D 与6-苄基鸟嘌呤( E) 反应得F;由NMT-Cl 对中间体F 的伯氨基进行保护,得到中间体G;在Dess-Martin 试剂作用下将羟基氧化成酮基得H;在Nysted试剂和四氯化钛的作用下进行亚甲基化反应得I;与盐酸反应脱去NMT 和嘌呤环上的苄基得J; 最后在三氯化硼作用下脱去碳环羟基上的苄基得恩替卡韦。
 


2 恩替卡韦的杂质谱分析


杂质谱的研究应依照国内外相关技术指导原则[8 - 13]进行。在药物研发中引入质量源于设计( QbD) 理念,已是国内外的普遍共识。QbD 是一个系统的药品开发方法,它以预想设定的目标产品质量特性作为研发的起点; 在了解产品关键质量属性( CQA) 的基础上,通过实验设计,研究物料的关键质量属性,确定关键工艺参数; 在多影响因素下,建立能满足产品性能和工艺文件的设计空间( Design Space) ; 根据设计空间,建立风险管理,确立质量控制策略和药品质量体系。


 



对原料药而言,关键质量属性( CQA) 一般包括,杂质谱( 有机杂质、无机杂质、残留溶剂和元素杂质) 、粒度、晶型和含量等。通过评估和确认关键质量属性,可以明确起始物料的关键质量属性、关键操作和关键工艺参数,来指导原料药的工艺研究和质量研究。
 
2. 1 工艺杂质  QbD 要求运用科学知识和经验,来充分评估目标产品的特性。杂质谱中的工艺杂质由制备工艺所决定。即使同一品种,不同研究者采用的起始原料、合成路线和工艺参数存在差异,工艺杂质也会有区别。故分析工艺杂质应结合实际工艺进行,不可盲目套用原研标准或其他相关标准。美国药典[7]共记载了8 个杂质,其中3 个杂质4-dimethylsilyl entecavir,entecavir related compound A 和furoentecavir是专利[6]中所揭示的合成副产物。本文中列举的合成路线( 图2)中,没有相同结构的起始原料、中间体,不会产生这些副产物。
 
工艺杂质,一般指制备工艺中的起始物料、中间体、溶剂、试剂,以及各步反应引入的副产物。恩替卡韦的合成路线中,起始原料有环戊二烯( A) 、氯甲基苄甲醚、6-苄氧基-2-氨基嘌呤( E) 和NMT-Cl 等,中间体有B,C,D,F,G,H,I 和J 等。这些起始原料或中间体中残存的一些杂质,会随着原料药的制备过程转化。为了避免给后续研究带来更大的难度,对起始原料或中间体中的杂质进行控制通常是一个好选择。
 
2. 2 立体异构体  作为另外一个重要的特性,恩替卡韦是( 1S,3R,4S)构型的单一异构体手性药物,含有3 个手性碳原子和23 = 8 个异构体。所以将立体异构体杂质规定为关键质量属性( CQA) 是完全必要的。应结合手性中心的构建过程,透彻研究反应机理,结合试验数据对异构体杂质进行定量分析,对其产生、转化、清除过程进行完整描述,从而实现对起始原料和中间体中的异构体杂质的充分控制。
 
立体异构体杂质具有共性。美国药典[7]记载了3 个立体异构体杂质,分别是1-epimer,3-epimer 和4-epimer。
 
恩替卡韦的立体异构体产生和传递示意图如图4。



 
表1 中同行的化合物表示具有转化关系,如中间体B 制备得到中间体C 和杂质C2;杂质C2 转化为F2; 最后转为ENT2。这些立体异构体的构型,以碳原子序号和碳原子构型的字母数字组合表示。



 
由A 制备B 和由B 制备C,这2 步反应涉及构建手性中心。化合物A 制备化合物B,引入了3 位和4 位2 个手性中心。这2 个手性中心在之后的反应中,不再参与反应。3 位碳原子在中间体F 中为R 构型,在中间体I 为S 构型,是因为2 位的基团发生了变化,致使与3 位碳原子相连的3 个原子排序发生了变化所致,而并非3 位碳原子发生了翻转。
 
化合物B 制备化合物C 引入了1 位手性中心,化合物D 与化合物C 手性构型相同。在由化合物D 制备化合物F 的步骤中,化合物E 对化合物D 的环氧三元环进行加成,使得1 位碳原子的构型由R型变为S 型。化合物F 以后的反应步骤中,1 位手性中心不再参与反应。
 
化合物C 具有4 个手性中心,但是2 位的手性中心,在由F 制备I 的过程,由手性羟基转化为无手性的亚甲基,从而恩替卡韦中只保留了3 个手性中心。
 
经过上述理论分析,就获知了恩替卡韦及其7个立体异构体的来源和转化过程,也就为建立手性控制策略提供了理论依据。
 
2. 3 基因毒性杂质[11]   基因毒性杂质( genotoxic impurity) 是指能直接或间接损害DNA,导致基因突变或具有致癌倾向的物质。其特点是在浓度很低时即可造成人体遗传物质的损伤,具有致突变性和致癌性,在用药过程中严重威胁到人类的健康。由于其高度的安全风险,基因毒性杂质一般可规定为原料药的关键质量属性。
 
基因毒性杂质的来源有起始原料、中间体、溶剂、试剂、反应副产物以及降解产物。对此类杂质的充分控制应基于对原料药特性和工艺特性的全面理解,并充分运用“避免-控制-清除”( avoid-controlpurge)策略。如尝试通过路线选择和优化尽量把基因毒性杂质的生成放在离最终产物4 步以外,并且在每一步分析工艺能否清除的可能性。对上述工艺进行耐受性研究和处理,在分离纯化之前,通过添加( spiking) 额外的杂质来检验纯化的强度。
 
结合恩替卡韦的合成工艺分析,潜在的基因毒杂质主要有以下几种: ① 化合物C 和D 是反应中间体,含有环氧乙烷的基因毒警示结构。② 苄氯是由中间体J 制备恩替卡韦的副产物,具有卤代烃的基因毒警示结构。③ 苄基氯甲基醚、4-甲氧基三苯基氯甲烷是恩替卡韦生产过程中使用过的试剂,含有卤代烃的基因毒警示结构。但是这2 个化合物对水极不稳定,易在反应后处理的过程中分解。一般有2 种研究策略: ① 通过研究其分解物来间接控制。例如NMT-Cl (4-甲氧基三苯基氯甲烷) 遇水不稳定,易完全转变为4-甲氧基三苯基甲醇有研究者通过研究其水解物,来间接检测NMT-Cl 的残留水平。② 预估清除因子的方法[14]。
 
2. 4 降解杂质  在原料药的杂质得到了全面控制的基础上,制剂主要关注的是降解杂质,要结合制剂处方、工艺等综合考虑。降解杂质由药物降解产生,如水解、氧化、开环、聚合等反应,与活性成分的结构特征密切相关。通过强制降解试验[15]可以在比加速试验条件更剧烈的条件下研究药物的降解途径与降解产物,从而确定分子的化学稳定性的方法。ICH 指导原则指出,强制降解试验旨在识别可能的降解产物,建立降解途径,明确分子的化学稳定性,并验证所选择的稳定性指示方法。
 


3 恩替卡韦的杂质控制策略


3. 1 申报起始原料的选择和源头控制  对于恩替卡韦而言,总的反应步骤长达9 步,申请人常采用市场上可供应的中间体作为申报路线的起始原料。申请人在选择和论证起始原料时应当遵循国内外相关指南和法规要求。如ICH 于2017 年7 月发布了新版的关于起始原料的选择问& 答文件《Q11: 原料药开发和生产( 化学实体和生物技术/生物实体药物) 问& 答》; EMA 于2016 年11 月发布了《活性物质化学部分指南》的新指南; 2016 年5 月,原国家食品药品监督管理总局发布了“关于发布化学药品新注册分类申报资料要求( 试行) 的通告( 2016 年第80 号) [12]”,公布了化学药品新注册分类申报资料要求( 试行) 。
 
在这些指导原则中,都规定“起始原料应为重要的结构片段并入原料药的结构中”,“重要结构片段”的选择原则旨在帮助其将试剂、催化剂、溶剂以及其他原料与起始原料区分开来。例如化合物D和E 即为“重要的结构片段”。
 
申请人应提交完整的起始原料质量标准,包括杂质限度。应全面评估起始物料的杂质谱,如有机杂质、元素杂质、残留溶剂和基因毒性杂质,在后续合成过程中保持不变或作为衍生物留存的可能性。应关注“持续存在”的工艺杂质。“持续存在”的杂质持续存在于原料药的多步反应中,它可能会、也可能不会在后续步骤中发生反应,但难以清除至可认为其对原料药杂质谱无影响的水平。申请人应评估起始物料中出现的杂质在常规工艺条件下的去向情况,并为其建立可接受的限度。有必要在起始物料中针对此类杂质,通过验证的检验方法,将其控制在合适的限度。
 
如选择化合物D 作为起始原料之一,其杂质谱中的有机杂质应涵盖化合物A,B,C 和化合物D 的其他7 个光学异构体; 化合物C 具有警示结构,故应以基因毒性杂质加以评估和控制; 制备工艺中使用的有机溶剂、可能引入的元素杂质亦应充分评估,并采取必要的控制策略。在上述杂质中,光学异构体是“持续存在”的工艺杂杂质,会对以后的多步反应产生影响,故应重点加以研究和控制。


未完待续


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