on style="vertical-align: inherit; line-height: 1.75em; box-sizing: border-box;">▲第一作者：张宁宁
论文DOI：10.1021/acscatal.1c05579
该文章首次提出了将天然非催化蛋白质和催化功能聚合物结合形成一种新型人工酶，命名为人工多聚酶。该人工酶不但具有与天然酶相似的理化性质，而且具有稳定性高、催化位点可调控等优势，以此可以有效地在催化水相中不对称羟醛缩合反应。该研究开辟了人工酶制备的新途径，扩展了基于脯氨酸的有机催化剂在不对称催化领域的应用。酶催化在现代合成中发挥着重要作用。然而，天然酶的自身催化特性极大地限制了其实际应用。为此，人工酶的概念应运而生。通过将各种小分子非生物催化剂并入到蛋白载体中赋予其新的催化活性或者选择性，例如，将有机金属催化剂和小分子有机催化剂引入到蛋白支架中，形成了人工金属酶和其他人工酶用于选择性合成。此前的众多研究充分证明了小分子催化剂和蛋白的结合在人工酶领域发展拥有巨大潜力。聚合物催化因其自身的众多优点已经成为一个很吸引人的领域，尤其是嵌段共聚物可以进行模块化设计，不仅能够提供多样的催化功能，还能通过大分子效应调节催化活性。鉴于此，聚合物催化剂已经被广泛应用到合成转化中，例如，聚合的L-脯氨酸用于催化羟醛缩合反应、分子印迹聚合物被用作为水解酶、聚合的过渡金属复合物用于非对称催化。这其中，脯氨酸催化的不对称羟醛缩合反应是形成C-C键的重要工具。但与天然的I型醛缩酶相比，基于脯氨酸催化的该反应在水中存在转化率低和选择性差等缺陷。通常的解决方案是将脯氨酸进行疏水化修饰生成异质性/胶体催化剂，但这会造成非均相催化反应，无法真正模仿醛缩酶。而理想情况是均相且水溶性的人工醛缩酶可以在水相中催化该反应，但是其发展也充满了挑战。基于以上研究背景，我们首次将天然蛋白质作为生物支架，与脯氨酸聚合物结合形成水溶性的催化剂用于水相的非对称羟醛缩合反应，实现了较高的催化活性的同时兼具优异的选择性。绿色荧光蛋白（GFP）因其具有产量高，荧光性，易于进行系统表征等优势而被选择作为蛋白支架。在GFP接枝L-脯氨酸聚合物可分为两步：（1）合成大分子引发剂，将小分子引发剂N-2-溴-2-甲基丙酰-β-丙氨酸N'-氧基琥珀酰亚胺酯通过酰胺偶联反应随机附着在GFP表面暴露的赖氨酸残基上，得到蛋白引发剂并命名为GFP MI；（2）在4℃的磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过原子转移自由基聚合法（ATRP）将不同数量的脯氨酸单体聚合到GFP MI上，从而得到三种不同聚合度的人工酶，分别命名为ArPolyGFP-H、ArPolyGFP-M和ArPolyGFP-L。▲Scheme 1. “Grafting-from” atom transfer radical polymerization (ATRP) approach for fabricating “artificial polyenzymes” (ArPoly) as aldolase mimics for asymmetric aldol reactions.
▲Figure 1. (a) MALDI-TOF mass spectra of native GFP and GFP MI. (b) SDS-PAGE results (lane 1: native GFP; lane 2: GFP MI; lane 3: ArPolyGFP-L; lane 4: ArPolyGFP-M; lane 5: ArPolyGFP-H). (c) FTIR (d) CD and (e) UV-Vis spectra for native GFP, GFP MI, and ArPolyGFP. (f) General photograph of native GFP, all three ArPolyGFP dissolved in water (2.5 mg mL–1).
通过MALDI-TOF 表征显示约20个引发剂分子成功连接到蛋白上；在SDS-PAGE结果中，天然GFP的离散带消失，而在高分子区出现连续带，从而确定了蛋白质聚合物偶联物的成功构建；通过红外光谱、圆二色谱、紫外-可见光光谱、荧光光谱确定了蛋白的二维和三维结构均没有受到聚合影响，证明聚合接枝是一个非常温和的反应过程。最终获得的蛋白质-聚合物偶联物具有如同天然GFP良好的水溶性，呈现出透明清澈绿色溶液（Figure 1f）。我们以环己酮和对硝基苯甲醛为底物，以水相中的不对称羟醛缩合反应为模型反应对人工多聚酶的催化性能进行了探索。研究表明，相比于其它对照实验组，ArPloyGFP对羟醛缩合反应具有更好的催化活性，ArPolyGFP-H、ArPolyGFP-M和ArPolyGFP-L的转化率分别为82%、67%和56%。随后，我们研究了pH值和温度对人工酶催化性能的影响，结果显示较低的pH能够实现较高的对映体选择性但同时也导致较低的转化率。相反，提高温度能大幅度提高转化率（56%）且不会牺牲选择性（91% ee）。这一结果表明了ArPolyGFP具有温度依赖性，另一方面也表现出其热稳定性的优势。然而，当温度进一步升高到55℃和65℃时，反应的选择性消失，这可能是因为高温使得蛋白质和聚合物之间的超分子相互作用减少，从而使反应不受控制。综合考虑转化率和选择性，pH 3.0和35 ℃被视为该人工酶的最佳催化条件，在此条件下，相比于游离脯氨酸和空白对照（均未发生催化反应），天然GFP（9% ee），脯氨酸聚合物（13% 转化率），ArPolyGFP实现了良好的转化率和选择性。随着蛋白质上的脯氨酸聚合物的增多，转化率从27%提高到33%，对映体选择性从86%提高到94%。ArPolyGFP-H催化不对称羟醛缩合效率最高，选择性最好。通过对照实验（天然GFP和脯氨酸聚合物的混合物）和反应机理分析，我们认为蛋白支架中的疏水环境可能是选择性提高的关键因素。此外，ArPolyGFP在水溶液和冻干状态下均表现出良好的稳定性。▲Table 1. Comparing catalysts for aqueous direct asymmetric aldol reactions of cyclohexanone with p-nitrobenzaldehyde under optimal conditions.
为了进一步证明该方法的通用性，我们选择了稳定、无反应特性的商业蛋白—牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白支架，在相同的条件下与脯氨酸聚合物结合，得到了ArPolyBSA-L、ArPolyBSA-M和ArPolyBSA-H并对其进行了表征。▲Figure 2. (a) MALDI-TOF mass spectra of native BSA and BSA MI. (b) SDS-PAGE results (lane 1: native BSA; lane 2: BSA MI; lane 3: ArPolyBSA-L; lane 4: ArPolyBSA-M; lane 5: ArPolyBSA-H). (c) Dynamic light scattering (DLS) results of native BSA and ArPolyBSA-H. (d) CD and (e) UV-Vis spectra for native BSA and ArPolyBSA. (f) General photographs of native BSA and all three ArPolyBSA dissolved in water (2.5 mg mL–1).
在最佳反应条件下，我们通过上述不对称羟醛缩合反应测试了ArPolyBSA的催化性能。结果表明ArPolyBSA能够实验较好的转化率和选择性。我们分析推测GFP和BSA催化性能的差异可能是由于其组成和结构的不同造成的。总之，结果表明各种蛋白质都可以用作人工酶的生物支架，这种方法用途广泛。我们进而分析了ArPolyBSA的底物范围，发现该人工酶可以催化带有不同吸电和斥电基团的丙烯醛，并在大多数反应中实现了很好的选择性和较好的转化率。▲Table 2. ArPolyBSA-H catalyzed aqueous direct asymmetric aldol reaction of cyclohexanone with various arylaldehydes.
我们提出了一种通过结合脯氨酸聚合物和蛋白质来创造人工酶的聚合物方法。通过该方法获得的人工多聚酶（ArPoly）不仅具备良好的水溶性，而且能在水中有效地催化羟醛缩合反应，实现了优异的对映选择性。这一发现具有重要意义，它证明了大分子有机催化剂具有能被设计定制成为人工酶的巨大潜力。此外，利用两种不同的蛋白质作为生物支架，我们证明了该方法在人工酶领域的稳健性和通用性。另一方面，更多的其他生物支架，从非活性蛋白到活性酶，都可以应用于该方法中产生多种多样的定制人工酶。南丹麦大学化学系的吴昌柱教授课题组专注于生物催化领域的研究，包括生物界面催化，人工酶，酶的固定化等用于级联反应及新型有机反应。https://www.wugroup.sdu.dk/https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05579
