论文DOI：10.1038/s41467-022-30915-2 受自然界启发，我们利用聚多巴胺包裹大肠杆菌的表面，构建起了人工孢子。得益于聚多巴胺良好的生物相容性和保护性，该人工孢子可以有效抵御紫外光、有机溶剂及有机-水界面张力等环境压力，维护细菌的代谢活力与酶的活性。此外，该人工孢子表面性质可调控，可以稳定有机-水两相乳液，增加底物与催化剂的接触面积，极大地提高了生物催化的效率。自然界中，生物体为了抵御环境中的不利因素，进化出了各自的防御机制。这其中，细菌孢子可以抵御多种环境压力，包括紫外光照射及化学试剂毒害，显示了其在生物合成领域的潜力。但自然的孢子多处于休眠状态，且其中的酶活性较低。为了解决这些问题，研究人员开发了人工孢子，即以保护性材料将细菌包裹于其中，保护细菌与酶的活性，有效提高生物催化效率，并拓展其在不对称合成及生物燃料制造等领域的应用。目前的人工孢子构建主要基于天然细菌及其本身自带的酶，这便大大限制了其在生物催化领域的应用范围。而相比之下，大肠杆菌作为最通用的重组酶表达平台，则没有在人工孢子化方面取得较大的进展。在此背景下，吴昌柱教授及其博士后孙志永(目前就职于浙江工业大学)受自然界启发，利用聚多巴胺的良好生物相容性及保护性，包裹大肠杆菌的表面构建人工孢子。该孢子体系可以有效抵御紫外光、高温、有机溶剂、有机-水两相界面张力的影响，维护细菌的代谢活性。同时，其内部可以表达多种酶，并应用于单酶及多酶的界面催化过程（图1）。此外，该孢子可以负载化学催化剂，并成功构建起化学-酶偶联催化体系，进一步丰富了细胞工厂的应用。▲Figure 1. Schematic of the coating on Escherichia coli (E. coli) cells as artificial spores for interfacial biocatalysis.
我们利用透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对人工孢子进行了直观的表征，原始的大肠杆菌作为对照也进行了表征。在TEM图像中，可以看到细胞外的包覆层（2e,2f）,而原始细菌外则没有。SEM表征中，我们可以直观看到颗粒状的包裹物和粗糙的表面（2g）,而原始细菌的表面相对光滑。综合SEM和TEM，人工孢子的形成得到了有效的证实。▲Figure 2. Characterization of artificial spores. a) Scheme of the artificial sporulation on an E. coli cell. Cross-sectional bright-field transmission electron microscopy (TEM) images of b) and c) a native E. coli cell at different magnifications, as well as e) and f) an artificial spore at different magnifications. Scanning electron microscopy (SEM) images of d) native E. coli cells and g) artificial spores.
之后，我们对包裹过程的生物相容性进行了验证。在细菌活/死实验中，通过与原始细菌对比（图3a），可以看到人工孢子有着较高的存活率（图3b,绿色）。此外，人工孢子的繁殖能力也与原始细菌相当（图3c）。▲Figure 3. Evaluation of the biocompatibility of the sporulation process. Live/dead assay for a) native E. coli cells and b) artificial spores; green - live cells; red - dead cells. c) Growth curve of native E. coli cells (green curve) and artificial spores (blue curve).
为了研究人工孢子对各种环境压力的抵御能力，我们分别施加紫外光、温度、有机溶剂以及有机-水两相界面张力等外界压力。在细菌的死/活实验以及酶活稳定性实验中，人工孢子的表现均大大优于原始细菌（图4）。例如，在紫外光照射下，原始细菌几乎全部失去活性，而人工孢子则有超过85%的存活率（图4b,4c）。此外，人工孢子中的酶活性也几乎是原始细菌的2倍（图4d）。在其他压力环境下，人工孢子也有着相似的存活率和酶活性。▲Figure 4. The protectability of artificial spores from external stress. a) Scheme of uncoated E. coli cell and artificial spore under ultraviolet (UV) light irradiation. Live/dead assay of b) uncoated cells and c) artificial spores after 2 h UV treatment. d) Benzaldehyde lyase (BAL) stability under UV treatment. e) Scheme of uncoated cell and artificial spore under interfacial stress (i.e., toluene-water biphasic condition). Live/dead assay of f) uncoated cells and g) artificial spores treated by 2 h interfacial stress. h) BAL stability under interfacial stress.
此后，我们通过对包裹材料组分的优化，成功构建了人工孢子稳定的皮克林乳液体系。利用两种不同的染料分别标记有机相与水相，证实我们得到了水包油型乳液（图5d）。此外，通过表达绿色荧光蛋白于细胞内，可以看到人工孢子分布于有机-水两相的界面上（图5f, 5g），该发现也通过SEM得到了直观的证实（图5h）。▲Figure 5. Characterization of Pickering emulsion. a) Scheme of emulsion preparation. b) Emulsion appearance at 0 h and 24 h. c) Optical microscopy image of the emulsions. d) Confocal laser scanning microscopy (CLSM) image of the oil-in-water emulsions; red – organic phase, green – aqueous phase. e) Scheme of emulsion droplet stabilized by artificial spores with green fluorescent protein (GFP). CLSM images of f) an individual emulsion droplet and g) an emulsion stabilized by artificial spores containing GFP. h) SEM image of an individual emulsion droplet surface.
我们首先表达酯酶CalB于大肠杆菌中，随后进行表面包裹，构建人工孢子。通过优化人工孢子表面亲疏水性、乳液体系的有机相-水相比例及人工孢子用量，该乳液体系的催化效率远高于其他两组对照试验（图6c）。此外，该人工孢子在重复多次利用的情况下，仍保持着较好的活性与催化效率（图6d）。由于大肠杆菌是一种广泛适用的酶表达平台，我们又在其他两种酶体系中进行了界面催化的拓展，同样显示出远远优于对照试验的结果（图6f,6h）。值得注意的是，由于人工孢子始终保持着代谢活性，使其在涉及辅酶再生的反应中，可以依靠自身的代谢路径完成辅酶再生而无需其他辅助。这将大大降低反应体系的复杂性和催化过程的成本，显示了该体系独特的应用优势。 ▲Figure 6. Investigation of interfacial biocatalysis for single-step reactions. a) A model esterification reaction catalyzed by CalB. b) Enzyme activity and surface area of emulsions with different oil-to-water ratios. c) Reaction profiles of CalB from artificial spore emulsion, silica particle emulsion and unemulsified biphasic system. d) Reuse of artificial spores. e) A benzoin condensation reaction by BAL. f) BAL-catalyzed reaction profiles in artificial spores emulsion and biphasic control. g) A cofactor regeneration within artificial spores for the reduction of acetophenone by alcohol dehydrogenase Rhodococcus ruber (ADH-a). h) ADH-a-catalyzed reaction profiles in artificial spores emulsion and biphasic control.
在单酶反应证实过可行性后，我们进一步将反应体系拓展到多酶催化。为此，我们设计了2种多酶耦联催化反应，如图7所示，在界面催化体系中的反应效率都远高于对照实验。▲Figure 7. Investigation of multienzyme cascades. a) Cascade reaction with alcohol dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus (ADH-ht) and CalB, b) their reaction profiles in artificial spores emulsion and biphasic control, inset is the emulsion picture by CLSM. c) Cascade reaction with ADH-ht and BAL, and d) their reaction profiles in artificial spores emulsion and biphasic control.
随后，我们进一步以人工孢子为载体，负载了金属催化剂钯，并通过TEM进行了钯纳米颗粒的分布表征（图8b,8c）。值得注意的是，金属催化剂的负载并没有影响人工孢子的繁殖能力（图8d）和乳化能力（图8f）。此外，我们设计了化学-酶偶联催化体系（图8g），并进一步证明了界面催化体系的优越性（图8h）。▲Figure 8. a) Schematic presentation of Pd-NPs-loaded artificial spores (Pd@AS). b) High-angle annular dark-field STEM image of a Pd@AS cross-section. c) STEM-EDXS-based Pd (pink) element map. d) Growth curve of artificial spores, the inset showing their growth on agar plate. e) Scheme of emulsion formation by Pd@AS. f) CLSM image of an emulsion stabilized by Pd@AS. g) Reaction scheme of chemoenzymatic cascades by Pd NPs and CalB, and h) their reaction profiles in artificial spores emulsion and biphasic control.
我们利用生物相容性的聚多巴胺包裹大肠杆菌，构建了可以抵御环境压力的人工孢子，并通过在其内部表达多种不同的酶，使其作为细胞工厂应用于单酶、多酶以及化学-酶耦联的界面生物催化过程。鉴于该细胞工厂的通用性以及化学催化剂的多样性，我们可以展望，以人工孢子为基础构建的界面催化体系将为二者的结合提供更多的可能性，并有望应用于解决合成工业上的难题。南丹麦大学化学系的吴昌柱教授课题组致力于酶催化及绿色化学的研究; 其研究重点是通过对酶及细胞的化学修饰获得new-to-nature的生物催化应用。https://www.wugroup.sdu.dk/希望对我们组研究方向感兴趣的研究人员与我们取得联系。我们课题组现在资金充足、年轻、有活力，具有较好的发展前景；目前我们招聘多个全奖的博士和博士后位置；丹麦的博士生、博士后的质量和待遇享誉全球。
