有机定制合成网

上海凯康镁科技有限公司 电话:021-51009326 化合物定制询价
专注化合物定制合成服务

氟标签衍生化联合氟固相萃取法在多肽纯化中的应用

随着多肽合成技术的发展,越来越多的多肽药物出现在了市场上。相对于绝大部分传统小分子药物来说,多肽药物具有活性高、毒性低、选择性高等优势,吸引了许多药物科学家的关注。但是多肽类药物具有易降解、在血浆中不稳定、基质干扰大、离子化效率低等缺点,给多肽分析造成了巨大困难。

<section style="white-space: normal; text-indent: 2em;">目前多肽的化学合成主要依靠固相合成方法,这种方法操作较为简单,但是随着肽链的延长,副产物在树脂上逐步积聚,导致目标多肽纯度显著降低,给终产物的分离和纯化带来巨大的困难。为了有效地纯化多肽,超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、HPLC等方法被相继开发出来,但是这些分离纯化的方法大多都是基于多肽的分子量大小、等电点、极性大小等性质来实现多肽和其他杂质的分离,选择性不高利用亲和力进行纯化的方法具有很高的选择性,但是传统的亲和力方法具有明显的局限性,比如会出现目标分子洗脱不完全、回收率低、使质谱谱图复杂化、亲和力方法所用试剂对价格昂贵等问题。


近年来,氟亲和技术逐渐发展起来,该方法已被用于催化剂的回收和再利用、反应中间体的去除、平行合成产物的共纯化以及各种基质中全氟化合物的检测和去除等,基于此技术,最近有科学家还合成了氟化探针,用于识别和分离生物蛋白。目前基于氟亲和原理的含氟固定相液相色谱氟固相萃取(fluorous solid-phase extraction,FSPE)被认为是复杂基质中分离纯化目标化合物最具潜力的方法之一

将FSPE引入多肽合成能极大简化多肽的纯化过程,引入氟标签的思路,大致分为2种:第1种是将氟标签连至反应终产物上,最后通过FSPE纯化以及除去氟标签得到目标产物;第2种是将氟标签试剂作为封端剂,使氟标签与未反应完全的裸露氨基连接,防止杂质参与后续的肽链增长反应,最后仅通过FSPE纯化即可得到目标产物,可省去去除氟标签的步骤,这2种思路各有利弊,第1种更加直观,第2种则可简化纯化步骤。

本文分别就基于FSPE原理的相关技术、氟标签的种类以及FSPE富集特殊肽的应用进行总结和阐述。


 - 1  基于FSPE原理的相关技术


1.1  标准FSPE

FSPE的基本步骤是先将含高氟化目标分析物的混合物上样至高氟化固定相[此处的“高氟化”,是指将烷烃基团中相应数量的氢原子(通常为7~20)替换为氟原子,目前使用的高氟化固定相一般为键合全氟烷烃链的硅胶],利用氟亲和力将高氟化物质保留在固定相上,然后再用疏氟溶剂(如甲醇水溶液)洗去杂质、用亲氟溶剂(如甲醇、乙腈、四氢呋喃)洗脱目标分析物,实现对目标分析物的分离和纯化。


1.2  反向FSPE

“反向FSPE”就是和“标准FSPE”相反,通过将亲氟固定相变为极性固定相、疏氟洗涤液变为亲氟溶剂,首先从色谱柱上洗下含氟标签的化合物,同时保留其余物质。

值得注意的是,含C4F9的物质由于含氟量较低,在标准FSPE中很难得到理想的分离效果,但是在反向FSPE中分离效果良好。另外,与标准FSPE相比,反向FSPE的优势在于该技术使用廉价的硅胶作为固定相以及能够被常规回收和再循环利用的含氟溶剂作为洗脱液,且当含氟化合物是待纯化的目标分析物时,由于其会首先流出,此时该方法会比标准FSPE更加快捷。


1.3  氟硅烷化多孔硅表面的激光解吸离子化质谱

多孔硅表面的解吸离子化质谱(desorption/ionization on porous silicon mass spectrometry,DIOS-MS)是由Buriak等于1999年提出的一种新的生物质谱分析方法,即利用多孔硅的特殊结构来吸收和传递能量,在分析样品时不需要加入基体,只需将样品直接点在多孔硅表面即可,消除了基体引入的背景干扰。

2007年,Go等用氟化试剂来修饰存在于臭氧氧化的多孔硅表面的羟基,生成了全氟烷基化的多孔硅DIOS表面,在用高比例有机溶剂洗去不含氟物质之后,直接进行DIOS-MS分析。结果表明,这种基于氟亲和力的DIOS-MS方法能够实现含氟标签小分子、多肽以及蛋白质的选择性富集和分析。


 - 2  氟标签种类


氨基和羧基这2个官能团是氨基酸的主要特征基团,所以在诸多氨基酸保护基中,针对氨基和羧基的保护基的研究尤为透彻。


2.1  与氨基相连的氟标签

2001年,Luo等成功地合成了一系列类似于叔丁氧羰基的氟化基团——氟化叔丁氧羰基,并且成功将此类试剂应用于氨基酸的氨基保护基,结构见图1。实验表明,当连接臂由3个亚甲基组成时,具有更好的分离效果。



2002年,Filippov等以苄氧羰基氯(benzyloxycarbonyl chloride,Z-Cl)为模板,在其苯环对位的位置取代上氟标签,合成了氟化苄氧羰基氯(fluorous benzyloxycarbonyl chloride,FZ-Cl);在FZ-Cl的邻位连上甲基,合成了FMZ-Cl;在FZ-Cl的结构基础上,将亚乙基连接臂替换为亚乙烯基,合成了FEZ-Cl(FZ-Cl、FMZ-Cl、FEZ-Cl的结构见图2)。



2003年,Curran等合成了另一类苄氧羰基类的氟化试剂——氟化苄氧羰基羟基琥珀酰亚胺酯,结构见图3。Curran等还对氟标签中全氟烷烃链的长度进行了考察,结果显示,C6F13在含氟填料上的保留时间较C8F17更短,所以C8F17成为了氟标签的首选。



2003年,Visser等将保护基甲基磺酰基乙氧基羰基的甲基部分替换为8个碳的氟标签,合成了新型氟化试剂——氟化甲基磺酰基乙氧基羰基氯,结构见图4。



2006年,Manzoni等将三氯乙氧基羰基氯的3个氯原子全部去除,换上8碳的全氟烷烃链,然后在临近的亚甲基上连上1个溴原子,合成了新的氟化试剂——氟化乙氧基羰基氯,结构见图5。它可以与多肽和寡糖的氨基发生反应,使得合成过程更简便、更快速。



9-芴基甲氧基羰基是现今多肽固相合成中使用最多的氨基保护基,在它的基础上,Matsugi等于2006年首次合成了氟化9-芴基甲氧基羰基羟基琥珀酰亚胺酯,结构见图6。2013年,Sugiyama等对此方法进行改进,发明了合成氟化9-芴基甲氧基羰基羟基琥珀酰亚胺酯(f-FMOC)的一锅法策略。2017年,Matsugi等将f-FMOC试剂作为氨基的保护基和氨基酸结构的编码标签,制备了几种在血管紧张素转换酶抑制试验中显示出高活性的三肽和五肽。



由于氟标签具有极强的疏水性,所有含氟标签的多肽在亲水溶剂中的溶解度都很差,当需要维持生理环境时(例如在磷酸盐缓冲溶液中),这种疏水性就限制了氟化合物在生物系统中的应用,并且这种疏水性可能导致与氟标签结合的蛋白质聚集。因此,水溶性氟标签的发现引起了化学家们的关注。

2011年,Qian等开发了一种新型的水溶性氟标记试剂——磺基-NHS-(OEG)3-全氟辛烷,其包含磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯基团(作为与多肽或蛋白的氨基部分反应时的离去基团)、酸不稳定的叔氨基甲酸酯基团、低聚乙二醇连接臂以及全氟烷烃链C8F17,结构见图7。



以上都是直接与目标产物连接的氟标签,还有一种氟标签是作为封端剂来使用的。2004年,Montanari等合成了一种三价氟碘鎓盐,结构见图8,在氨基酸脱保护和最后裂解的反应条件下都有很好的稳定性,且一旦游离氨基被这种试剂烷基化,它们在进一步的多肽偶联步骤中将不发生反应。实验结果表明,利用此封端剂合成多肽后,经过FSPE纯化,合成过程中产生的缺失序列杂质被完全去除。



2.2  与羧基相连的氟标签

与氨基相比,连接在羧基上的氟标签较少。2001年,Pardo等合成了一系列叔丁醇类的氟化试剂——氟化叔丁醇,结构见图9。这些试剂是由对应的含全氟烷烃链的格氏试剂丙酮乙酸乙酯反应生成。和叔丁氧羰基类氟化试剂相似,这些氟化试剂含有2条全氟烷烃链。



2006年,Fustero等以2-(三甲基硅烷基)乙醇为模板,制备了一种新型的氟代醇——氟化2-(三甲基硅烷基)乙醇,结构见图10



氟标签作为辅助纯化的工具,对其进行回收和再利用是一种既能降低成本,又能对环境有利的做法,例如在利用氟标签辅助合成寡糖的过程中,苄基型氟标签便是一种可回收的氟标签。然而在多肽合成中,大部分氟标签的回收存在一定难度,因为在用强酸去除氟标签的同时,氟标签会被部分分解。2005年,Goto等合成了能通过简便方式回收的氟化试剂,它是一个含有6条全氟烷烃链的醇,与氨基酸残基的羧酸基团发生反应而使之带上氟标签,结构见图11。



 - 3  特殊肽的富集


3.1  硝化肽的富集

2011年,Kim等开发了基于氟亲和力的纯化富集硝化肽的方法。该方法通过三步反应,在硝基部分连上氟标签:

  • ①乙酰化,此步骤用来保护N末端胺基和赖氨酸残基的ε-胺结构;

  • 还原反应,将硝基还原为伯氨基;

  • ③氟化,将氟标签连接至生成的伯氨基处。

在衍生化完成后,通过FSPE富集得到带有氟标签的硝化肽,质谱结果显示,反应转化完全,并且能有效富集硝化肽。


3.2  磷酸化肽的富集

2016年,Zhao等首次设计并合成了全氟化的磁性介孔微球(Fe3O4@mSiO2-C8F17)。磷酸化多肽经过β-消除和迈克尔加成反应,生成含有氟标签的磷酸化多肽。然后,通过Fe3O4@mSiO2-C8F17富集含氟标签的磷酸化多肽,并与未标记的多肽磁性分离,随后将其洗脱进行质谱检测。实验结果显示,这种全氟化磁性介孔微球具有出色的分散性,对含氟标签的多肽具有良好的富集能力以及特异性。


3.3  4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)修饰肽的富集

2017年,Yuan等开发了一种基于氟衍生化和FSPE的新方法来富集4-HNE修饰的多肽。在这种方法中,多肽首先通过4-HNE中的醛基与氟化试剂的氨基氧基之间发生肟点击化学反应,使多肽连上氟标签;随后,通过FSPE进行纯化和富集。实验结果表明,这种方法十分快速以及有效,使用这种新颖的方法成功鉴定了432种蛋白质上的661个4-HNE修饰肽上的673个4-HNE修饰位点。


 - 4  总结与展望


基于氟亲和原理的FSPE因其高特异性、普适性以及操作的简便性,得到了很多科学家的关注和研究。本文综述了多肽氟标签的种类、FSPE在多肽合成、纯化和富集中的应用以及相关技术。这些方法尽可能多地简化了合成纯化步骤,对复杂反应体系中的目标产物进行有效的选择性富集;并且与多种分析方法兼容,有利于对目标产物的后续分析。FSPE在多肽纯化方面的应用还有很大的发展空间,目前应用于多肽纯化的氟标签基本都集中于氨基和羧基上,即使是富集一些特殊肽,也是将其中的特殊基团转化为氨基之后再进行富集,所以发明更多样化的氟标签设计和含氟固定相,以满足不同反应体系和富集不同翻译后修饰肽的需求是今后拓展其在多肽领域应用的关键。但目前已有的研究结果足以证明这个技术在多肽研究领域的独特优势和潜力。


注:本文表述有所精简,详细内容请查看原文(点击此处查看pdf原文)。


作者简介

第一作者:

尤淞涛,男,硕士,中国药科大学药物分析学专业,以第一作者发表中文核心期刊论文一篇。


通信作者:

狄斌,中国药科大学药物分析学教授、博士生导师,药学院副院长,国家禁毒委员会办公室-中国药科大学禁毒关键技术联合实验室主任。研究方向:药物分析新材料与新技术;多肽与蛋白质药物研究;药物体内外质量评价; 禁毒关键技术研究。第十一届国家药典委员会委员,中国药学会药物分析专业委员会委员,中国药科大学学术委员会委员。药物分析杂志编委,中国药科大学学报编委,中国现代应用药学杂志编委。江苏省教育厅优秀科技创新团队负责人,江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人,江苏省 “333工程”第三层次培养对象。主持国家自然基金面上项目3项,国家新药创制重大专项,科技部重点研发计划课题负责人。获上海市科技进步二等奖,上海药学科技三等奖,中华中医药学会科学技术奖三等奖,江苏省优秀硕士论文指导教师。主编药物分析实验双语十一五规划教材,参编人卫版《药物分析》国家十二五规划教材,参编其他药物分析相关教材及专著10本。“药物分析”国家精品课程、国家双语示范课程、国家网络资源课程核心成员。获“国家教学成果”二等奖,“江苏省教学成果”特等奖,江苏省教学成果二等奖。


徐莉莉,讲师。目前主要从事抗炎新药分子发现、设计及功能探针用于靶标蛋白垂钓确证等化学生物学研究,并在知名期刊如Analytical Chemistry,Journal of Medicinal Chemistry,Free Radical Biology and Medicine,European Journal of Medicinal Chemistry,Oxidative Medicine and Cellular Longevity,Dalton Transactions等发表SCI论文20余篇,主持国家自然科学基金青年基金一项,主持江苏省自然科学基金青年基金一项,主持中国博士后基金面上项目一项。


有机定制合成网 » 氟标签衍生化联合氟固相萃取法在多肽纯化中的应用

咨询化合物定制合成与纳米材料 提供技术支持和售后服务

咨询定制合成 购买化合物产品
在线营销
live chat
no cache
Processed in 0.530172 Second.